C9orf72突变携带者神经兴奋性特征：从无症状期到肌萎缩侧索硬化症的转化机制与生物标志物探索

本研究通过神经兴奋性测试（nerve excitability testing）揭示C9orf72突变携带者在无症状期即存在钠离子通道功能异常（Na+-window currents减少），表现为低兴奋性（hypoexcitability）；而C9orf72-ALS患者则呈现超兴奋性（hyperexcitability）特征，与钠通道恢复延迟相关。该发现为ALS早期生物标志物开发及靶向干预提供了重要电生理依据。

　　

引言

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种累及上下运动神经元的毁灭性神经退行性疾病，其发病与遗传和环境因素密切相关。C9orf72基因的六核苷酸重复扩增（GGGGCC）是最常见的ALS相关突变，约占家族性ALS病例的40%和散发性病例的6%。然而，该突变的外显率不完全，迫切需要能在症状前阶段识别高风险个体和早期疾病迹象的生物标志物。

尽管神经影像学和神经丝轻链（NfL）等生物标志物已用于研究无症状C9orf72携带者，但运动神经元兴奋性的关键病理生理变化在运动单位丢失前即可发生。神经兴奋性测量技术已被证明能追踪ALS中各种离子通道调节化合物的靶点参与，但C9orf72突变对体内周围神经兴奋性特性的影响尚不明确。

研究方法

研究参与者

本研究经乌得勒支大学医学中心医学伦理委员会批准，所有参与者均签署知情同意书。最终研究队列包括：来自C9orf72 ALS家族的无症状个体（包括携带者C9⁺和非携带者C9^?）、C9orf72 ALS患者和散发性ALS患者，以及健康对照。

无症状个体入选标准为：无可能影响神经兴奋性测试的周围神经疾病史，且不依赖于是否知晓自身突变状态。检查者在神经生理学评估时对突变状态保持盲态。所有参与者均接受标准化神经学检查，确保无症状状态定义为无上下运动神经元疾病及认知行为改变迹象。

ALS患者符合Gold-Coast诊断标准，并经过C9orf72重复扩增筛查，排除其他已知ALS相关突变（如FUS、SOD1、ATXN2）。使用修订版ALS功能评分量表（ALSFRS-R）、精细运动功能子域评分（FMF）和神经学检查结果进行临床分期。

神经生理学方案

记录使用QTRAC软件进行，从拇短展肌（APB）记录复合肌肉动作电位（CMAP）。正中神经在腕部水平刺激，记录前使用37°C水毯预热参与者手臂30分钟以减少温度引起的变异性。

首先进行CMAP扫描（详细刺激-反应曲线），通过MScanFit程序转换为运动单位数估计（MUNE），用于评估无症状家族成员是否存在客观检测不到的轴突损失。随后进行标准化神经兴奋性测试，包括：强度-持续时间测试（刺激电荷与持续时间关系）、阈值电紧张测试（对20%和40%去极化和超极化条件电流的阈值变化）、电流-电压测试（对200ms条件电流的阈值变化）和恢复周期测试（在200ms至2ms递减刺激间隔后阈值变化）。

生物物理学复合兴奋性测量

基于先前研究，将记录的兴奋性数据分离为四种独立的变化模式，分别对应不同的生物物理机制：膜极化（受Na⁺/K⁺泵电流调节）、慢钾通道门控动力学、钠通道门控特性和通透性（反映总Na⁺窗电流）、神经不应性。这些模式通过将标准兴奋性测量子集组合成四个复合兴奋性测量来近似表示，从而在个体水平上提供对调节轴突兴奋性机制的见解。

统计分析

使用广义线性模型比较组间差异，年龄和性别作为协变量。对于来自同一家族的无症状个体，基于谱系构建亲缘关系矩阵作为线性混合效应模型的随机效应协方差矩阵，以增强检测基因驱动表型的能力。所有比较的P值经Tukey's honest significant difference检验校正。

研究结果

人口统计学特征

研究共纳入23名（49%）无症状C9⁺和24名（51%）C9^?个体。ALS患者中11名（9%）为C9⁺，110名（91%）为C9^?。无症状组间或ALS患者组间在人口统计学变量上均无差异。最相关的肌肉分期变量MUNE在无症状组间无差异（W = 260, p = 0.733）。神经学检查结果显示，无症状家族成员均无下运动神经元或上运动神经元功能障碍迹象。

无症状C9orf72携带者的兴奋性特性

总体而言，未考虑亲缘关系时，无症状C9⁺和C9^?个体之间未发现显著差异。与健康对照相比，无症状C9⁺个体的任何测量值也无显著差异。

随后重点分析了来自同一家族的无症状C9⁺和C9^?携带者（共26人，其中12人为C9⁺）。即使考虑了家族间遗传变异性，两组间的标准兴奋性测量仍无显著差异。然而，复合兴奋性测量三值（指示节点钠电流）在无症状C9⁺个体中较低（平均值±标准误：C9⁺ = ?2.41 ± 1.09, C9^? = 0.70 ± 0.90; t = ?1.93, p = 0.034）。构成该复合测量的标准兴奋性测量值（包括TEh_90-100ms、TEh_Overshoot、超兴奋性和亚兴奋性、SDTC）均无显著差异，但SDTC的效应量最大（C9⁺ = 386 ± 19 μs, C9^? = 441 ± 25 μs; t = ?1.65, p = 0.067）。这些测量值的组间差异一致导致复合三值降低，表明兴奋性变化模式与无症状C9⁺个体中较小的Na⁺窗电流一致。

C9orf72 ALS患者的兴奋性特性

C9⁺ ALS患者的平均记录与C9^?患者大体相似，最显著差异出现在恢复周期的不应期区域。C9⁺患者表现出比C9^?患者更大的2ms不应性、相对不应期（RRP）和S2适应（t = 4.58, p < 0.001; t = 3.43, p = 0.002; t = 2.66, p = 0.023）。这表明由于从失活恢复较慢，延长了Na⁺离子流入轴浆，导致超兴奋性。尽管2ms不应性是C9⁺ ALS患者复合兴奋性测量四平均值的主要驱动因素，但构成该复合测量的其他标准兴奋性测量（SDTC、TEd_40-60ms、S2和超兴奋性）的总体贡献可忽略，因此两组间复合测量四的差异未达显著性（t = 2.23, p = 0.069）。

与对照相比，C9⁺患者的2ms不应性更大（t = 3.76, p < 0.001），而C9^?患者则无此差异（t = ?1.23, p = 0.436）。尽管实施了专门的加温程序，温度与2ms不应性仍存在强相关性（R [95% CI] = ?0.33 [?0.44, ?0.20], p < 0.001）。敏感性分析显示，即使添加温度作为协变量，C9⁺患者的2ms不应性、RRP和S2适应仍显著大于C9^?患者（t = 4.37, p < 0.001; t = 3.19, p = 0.005; t = 2.59, p = 0.028）。

讨论

本研究显示，C9orf72突变携带者（包括无症状个体和患者）具有独特的周围神经兴奋性特征，可能表明独特的电生理表型。基于生物物理学复合兴奋性测量，钠窗电流减少是无症状C9orf72携带者与非携带者之间差异的最可能机制，可能导致低兴奋性。在患者中，C9orf72携带者相比散发性ALS患者表现出更大的恢复周期不应性，这可能由Na⁺通道从失活恢复较慢所主导，延长Na⁺离子流入并导致超兴奋性。

无症状期的细微兴奋性差异提示，在客观检测到运动神经元损失之前，神经兴奋性变化已然发生。C9orf72 ALS患者的不应性改变可能源于轴突、神经肌肉接头或肌膜，但肌膜兴奋性变化在ALS中可能性较小。需要进一步研究通过双重条件恢复周期协议等技术来定位这些变化的起源。

研究局限性包括仅从单臂单时间点记录，但通过严格排除其他神经肌肉疾病患者最小化了混杂因素。部分无症状个体是其家族中的唯一参与者，但大多数为相关个体，组成了迄今为止最大的无症状C9orf72携带者神经兴奋性测量数据集。C9orf72 ALS患者比例较小（9%）符合一般人群预期，但小样本量结合兴奋性测量的显著变异可能导致检测差异的敏感性降低。

结论

ALS被认为是一种多步骤疾病，散发性ALS比C9orf72 ALS等遗传变异需要更多步骤发展。本研究证明C9orf72突变携带导致独特的电生理表型：无症状期表现为由较小Na⁺窗电流介导的低兴奋性，而ALS患者则因Na⁺通道恢复延迟导致超兴奋性。追踪无症状C9orf72携带者从低兴奋性向超兴奋性转换的过程，可能有助于揭示疾病发作的早期迹象。未来研究应用这些技术纵向跟踪C9orf72携带者，将有助于进一步理解无症状个体向ALS的表型转化机制。