基于对位联芳基磷酸酯的STAT4转录因子抑制剂：结构活性关系与选择性研究推动自身免疫疾病治疗新策略

本综述聚焦于信号转导与转录激活因子（STAT）4作为自身免疫疾病治疗靶点的重要性，系统阐述了对位联芳基磷酸酯类抑制剂的构效关系与选择性优化。研究通过对磷酸酯骨架的芳环修饰，开发出高效选择性抑制剂Stafori-2（8f），其通过靶向STAT4 Src同源2（SH2）结构域，在荧光偏振（FP）实验和等温滴定量热（ITC）分析中均展现优于前代化合物Stafori-1的抑制活性（Ki=0.18±0.03 μM），为开发新型免疫调节剂提供了关键分子基础。

　　

1 引言

信号转导与转录激活因子（STATs）是一类将细胞表面信号传导至细胞核的转录因子。其中STAT4在多种自身免疫疾病（如多发性硬化症、类风湿关节炎和1型糖尿病）中发挥关键作用。在白介素-12刺激下，STAT4酪氨酸693位点发生磷酸化，进而促使T辅助细胞向Th1亚群分化。靶向STAT4 Src同源2（SH2）结构域的小分子抑制剂有望为这些未满足临床需求的疾病提供新型治疗策略。

对位联苯磷酸（1）作为STAT4 SH2结构域的选择性抑制剂（K_i=1.1 μM）被首次报道，随后逐步优化为对位联芳基磷酸化合物2（K_i=0.35 μM）及其α,α-二氟苄基膦酸酯类似物3（K_i=4.0 μM）。通过对化合物3上芳环的结构修饰，研究团队最终开发出选择性STAT4抑制剂Stafori-1（K_i=1.7±0.2 μM）。近期研究发现P2X受体拮抗剂PPADS和iso-PPADS也能靶向STAT4及其他STAT蛋白。

2 结果与讨论

Stafori-1作为α,α-二氟苄基膦酸酯衍生物，其下环为2-氟取代苯环，上环为5-甲基-3-噻吩基团。为探究最优芳环取代模式是否受α,α-二氟苄基膦酸酯基团影响，本研究系统分析了磷酸酯背景下联芳基的结构活性关系。

通过Suzuki偶联反应，3-氟-4-羟基苯硼酸（4）与芳基溴化物5反应生成4-芳基-2-氟苯酚6d-f。非氟化4-芳基苯酚6a-c为市售品。对位芳基苯酚6a-f经过Atherton-Todd磷酸化反应得到苄基保护的磷酸酯7a-f，再经TMS-Br介导的脱苄基反应生成目标化合物8a-f。

活性测试表明，将对位联苯磷酸（1）的上环苯基替换为3-噻吩基（8a）可使STAT4抑制活性提升两倍（K_i=0.56±0.06 μM），且对其他STAT蛋白（STAT1、STAT3、STAT5a、STAT6）的抑制活性基本不变，选择性显著改善。含2-噻吩基的衍生物8b对STAT4具有相似活性（K_i=0.50±0.03 μM），但丧失了对STAT5a和STAT5b的选择性。2-噻唑基衍生物8c对STAT4的抑制活性较8a降低约八倍（K_i=4.1±0.2 μM）。噻吩衍生物8a和8b的活性与先前报道的2-萘基衍生物9（K_i=0.44±0.09 μM）相当，且优于1-萘基衍生物10（K_i=0.84±0.08 μM）。

在稠合三环磷酸酯11和12中，两个芳环通过亚甲基桥或氧原子固定相对取向。亚甲基桥联化合物11（K_i=0.61±0.03 μM）对STAT4的活性略高于二苯并呋喃12（K_i=0.71±0.08 μM），但对STAT1、STAT3和STAT6的选择性较低。综合来看，噻吩衍生物8a和8b在本系列中表现最佳，其活性优于对位联苯磷酸（1），避免了9和10中大疏水性萘基的使用，且合成可操作性优于稠合三环化合物11和12。

在下环邻位引入氟原子的对位联苯磷酸衍生物13（K_i=0.56±0.08 μM）对STAT4的活性较化合物1提升两倍。在该2-氟苯磷酸酯背景下，将上环苯基替换为噻吩基得到化合物8d（K_i=0.26±0.02 μM）和8e（K_i=0.30±0.003 μM），两者活性均优于13。在3-噻吩基5位引入甲基得到化合物8f，即膦酸酯Stafori-1的磷酸酯类似物。该化合物被命名为Stafori-2，在FP实验中显示出最强的STAT4抑制活性（K_i=0.18±0.03 μM），且对其他STAT家族成员具有良好的选择性。

通过等温滴定量热（ITC）验证了8f与STAT4的结合（K_d=3.1±1.0 μM），对照组未检测到热信号。8f的结合活性较相应膦酸酯Stafori-1（K_d=7.1±1.1 μM）强两倍以上，但较萘基磷酸酯2（K_d=1.3±0.3 μM）低两倍，尽管8f在FP实验中显示更高活性。这种差异可能源于检测方法原理和缓冲体系的不同。热力学参数分析表明，磷酸酯8f的焓贡献显著大于膦酸酯Stafori-1，而Stafori-1的熵贡献更大，提示磷酸酯8f的桥氧原子可能与STAT4形成氢键相互作用，这一假设需通过共晶结构分析验证。

3 结论

本研究系统分析了对位联芳基磷酸酯上芳环结构对STAT蛋白抑制活性的影响。将5-甲基-3-噻吩基上环与2-氟苯磷酸酯下环组合，得到了最强效的对位联芳基磷酸酯8f（Stafori-2）。作为Stafori-1的磷酸酯类似物，Stafori-2在FP实验和ITC分析中均显示更强的STAT4抑制活性。然而与Stafori-1不同，Stafori-2可能易被磷酸酶水解，这有待进一步研究。此类STAT4小分子抑制剂可作为化学探针，或进一步开发为靶向STAT蛋白的分子胶或蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）。