脂质纳米颗粒介导双链DNA靶向递送治疗遗传性视网膜病变的创新研究

本文系统探讨了脂质纳米颗粒（LNP）在介导双链DNA（dsDNA）治疗遗传性视网膜疾病（IRDs）中的应用前景。研究通过引入NHS功能化PEG脂质（DSPE-PEG2K-NHS）构建新型LNPx载体，成功实现对视网膜色素上皮（RPE）与光感受器细胞的高效转染，突破了现有rAAV载体容量限制（<5?kb），为Stargardt病（ABCA4）、Usher综合征（MYO7A）等大基因突变IRDs的基因治疗提供了非病毒递送新策略。

　　

Highlight

LNPx载体成功将dsDNA递送至C57BL/6J小鼠视网膜

LNPx与dsDNA形成的颗粒尺寸＜100 nm，多分散指数＜0.25（图S1A），表面带负电荷（-3 mV至-10 mV）（图S1B），封装效率达85-95%（图S1C）。这些特性与先前mRNA制剂报道一致。将LNPx用PBS稀释后开展体内实验。通过亚视网膜注射将编码绿色荧光蛋白（GFP）的dsDNA（pCMV-GFP，4.7 kb）递送至小鼠视网膜，采用活体多模态成像技术监测基因表达。

Results

LNPx介导的dsDNA表达在视网膜中持续28天

注射后7天，共聚焦扫描激光 ophthalmoscopy（cSLO）检测到强劲的GFP信号，主要分布于注射部位（图1A）。信号强度在14天达到峰值（图1B），直至28天仍可检测（图1C），而对照组（PBS注射）始终无信号（图1D）。定量分析显示，7天时平均荧光强度为124.7±19.11 AU，14天升至153.2±35.21 AU，28天降至95.87±25.11 AU（图1E）。

LNPx介导的dsDNA转染多种视网膜细胞类型

注射后14天采集视网膜进行免疫组化分析。LNPx处理组中，GFP表达见于视网膜色素上皮（RPE）、光感受器外节（OS）、内节（IS）、外核层（ONL）及 Müller胶质细胞（图2A-C），而对照组无表达（图2D）。值得注意的是，dsDNA成功转染了难以靶向的光感受器细胞。

LNPx介导的dsDNA递送未引起显著视网膜毒性

注射后7天和28天进行光学相干断层扫描（OCT）评估视网膜结构完整性。与对照组相比，LNPx处理组未出现视网膜层间分离或形态学异常（图3A-D）。视网膜各层厚度测量显示实验组与对照组无显著差异（图3E），表明LNPx递送dsDNA不会造成视网膜结构损伤。

LNPx在视网膜中诱发轻微且短暂的炎症反应

注射后7天，LNPx组出现少量GFAP阳性细胞（星形胶质细胞激活标志）和IBA1阳性细胞（小胶质细胞/巨噬细胞标志），但至28天时基本消退（图4A-F）。对照组仅在注射点附近有轻微反应（图4G-I）。qPCR分析显示炎症因子（Tnfα、Il-6、Ccl2）在7天时短暂上调，28天时回归基线水平（图4J-L）。

Conclusion

本研究首次证实经DSPE-PEG_2K-NHS修饰的LNPx可高效递送dsDNA至视网膜多种细胞类型（包括光感受器），表达可持续28天且不引起显著结构损伤或持续炎症反应。这为开发基于非病毒载体的大基因突变IRDs治疗策略奠定了重要基础。