CFAP91通过邻近标记技术鉴定精子特异性运动调节因子EFCAB5，揭示轴丝蛋白组装新机制及其在男性不育中的作用

本研究针对精子鞭毛轴丝径向辐条RS3蛋白CFAP91的功能未知问题，通过构建Cfap91基因敲除小鼠模型，结合转基因挽救、邻近标记和蛋白质组学技术，发现CFAP91是RS3组装的关键支架蛋白，并鉴定出精子特异性运动调节因子EFCAB5。研究证实CFAP91缺失导致精子鞭毛形成障碍和男性不育，而Efcab5敲除则引起精子运动能力下降。该研究为男性不育的病因诊断和治疗提供了新靶点，发表于Nature Communications。

　　

在哺乳动物的生殖过程中，精子需要通过鞭毛的摆动运动才能完成受精使命。鞭毛的核心结构——轴丝（axoneme）——是由微管蛋白构成的精密细胞器，其外围九组双联微管（doublet microtubules）上附着着称为径向辐条（radial spokes, RSs）的蛋白复合物。这些辐条结构如同机械传动装置，通过调控动力蛋白（dynein）的活性来控制鞭毛的弯曲运动。在三种径向辐条（RS1、RS2和RS3）中，RS3在进化上最不保守，且在精子轴丝中具有独特的桥接结构，暗示其可能参与精子特异性运动的调节。

然而，关于RS3的具体组成和功能机制仍存在大量未知。临床研究发现，人类CFAP91基因的双等位基因突变会导致严重的弱畸精子症（astheno-teratozoospermia），表现为精子运动能力丧失和形态异常。虽然CFAP91被预测为RS3的组成蛋白，但其在精子发生过程中的具体功能以及相互作用网络仍有待阐明。

为了解决这些问题，日本大阪大学微生物病研究所的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们通过多学科交叉的研究方法，揭示了CFAP91在精子鞭毛组装中的核心作用，并发现了一个精子特异性的运动调节因子EFCAB5。

研究团队主要运用了基因编辑技术（CRISPR/Cas9系统）构建基因敲除小鼠模型、转基因挽救实验、免疫共沉淀联合质谱分析（IP-MS）、生物素邻近标记（BioID2）技术、免疫组织化学、超微结构分析（透射电镜）以及计算机辅助精子分析（CASA）等关键技术方法。其中人类精子样本来自健康捐赠者。

Generation of Cfap91 KO mice

研究人员首先通过CRISPR/Cas9技术成功构建了Cfap91基因敲除小鼠。组织表达分析发现Cfap91主要在睾丸中高表达，在肺中低表达，且在出生后14天的小鼠睾丸中开始表达，与精子发生周期中初级精母细胞的出现时间相符。值得注意的是，在纯合子敲除小鼠的繁殖中，研究人员发现B6D2背景的小鼠存活率极低（仅5.6%），且均在8周前死亡，而通过与129品系杂交获得的B6D2/129背景小鼠则能获得正常孟德尔分离比的纯合子个体，表明遗传背景显著影响Cfap91缺失的表型外显率。

Ablation of Cfap91 resulted in male infertility, accompanied by defective spermiogenesis

Cfap91纯合敲除雄性小鼠完全不育。组织学分析发现其睾丸中生精小管中缺乏延伸的精子尾部，免疫组化显示精子尾部显著缩短。进一步观察发现，敲除小鼠的延长/伸长型精细胞出现头部形态异常，表明精子发生过程存在缺陷。

Cfap91 KO males showed oligo-astheno-teratozoospermia

对附睾精子的详细分析证实，Cfap91敲除小鼠表现为典型的少弱畸精子症：附睾变小变轻、精子数量减少、尾部缩短、头部畸形且完全无运动能力。有趣的是，尽管CFAP91在纤毛中也有表达，但敲除小鼠的室管膜和气管纤毛并未出现明显异常，说明CFAP91的功能在精子鞭毛中具有特异性。

为了研究精子头部形态异常的机制，研究人员构建了EGFP-Tuba3a转基因小鼠，利用睾丸特异性Clgn启动子表达EGFP标记的TUBA3A蛋白，成功实现了对微管鞘（manchette）的动态观察。发现在Cfap91敲除小鼠中，微管鞘异常延长，导致精子头部形态发生障碍，这表明鞭毛形成缺陷可能间接影响了微管鞘的正常功能。

透射电镜超微结构分析进一步揭示了Cfap91敲除精子中的多种缺陷：睾丸精细胞中微管结构紊乱，附睾精子中轴丝结构破坏，线粒体鞘、外周致密纤维和纤维鞘均出现异常。特别值得注意的是，电子致密的环状结构（annulus）未能正常向远端迁移，导致中段和主段的界限异常。

Cfap91 transgene was able to rescue the fertility of Cfap91^-/- males

为了确认表型确实由Cfap91缺失引起，研究人员构建了转基因挽救小鼠，在Cfap91敲除背景下表达C末端带有BioID2和3xFLAG标签的CFAP91蛋白。结果表明，转基因表达完全恢复了精子的正常形态、运动能力和生育力，证实了表型的特异性。

CFAP91 is localized in sperm tails and fractionated with axonemal proteins

通过免疫荧光和细胞化学分析，发现CFAP91在圆形精细胞时期同时存在于细胞质和尾部，随着精子发生进程，细胞质中的信号逐渐减少，而尾部信号增强，表明CFAP91在细胞质中合成后被运输到正在组装的鞭毛中。蛋白质分级分离实验证实CFAP91存在于SDS可溶的轴丝组分中。

CFAP91 immunoprecipitates with RS3 proteins during spermiogenesis

通过免疫共沉淀-质谱分析（IP-MS），研究人员鉴定出45种与CFAP91显著相互作用的蛋白质，其中7种是已知的哺乳动物精子RS3组分（CFAP91、AK7、AK9、CATIP、CFAP251、LRRC23和MDH1B）。免疫印迹验证了CFAP91与CFAP251和LRRC23的直接相互作用。重要的是，在出生后15天（P15）的睾丸中，CFAP91已经与CFAP251结合，而与LRRC23的结合则发生在更晚的阶段，表明RS3的组装是分步进行的。

在Cfap91敲除小鼠中，CFAP251和LRRC23无法正常定位到精子尾部，虽然在睾丸中的蛋白水平没有变化，但在成熟精子中显著降低。同时，鞭毛组装相关蛋白IFT140在敲除精子中异常滞留，表明鞭毛组装过程在CFAP91缺失的情况下被中断。

CFAP91 immunoprecipitates with BBSome proteins during spermiogenesis

研究还发现CFAP91与BBSome蛋白复合物（BBS1、BBS2、BBS5、BBS7和BBS9）存在相互作用。BBSome在纤毛/鞭毛的蛋白质运输中起关键作用，其单个成员的敲除都会导致小鼠精子鞭毛缩短。在Cfap91敲除睾丸细胞中，BBS2的信号分布不均匀并在细胞质中形成焦点，提示CFAP91可能通过BBSome参与鞭毛形成过程。

Proximity labeling in mature spermatozoa was able to detect EFCAB5 as a sperm-specific RS3 protein

为了解决成熟精子轴丝蛋白难溶解的问题，研究人员创新性地应用了邻近标记技术。将Cfap91^-/- TG小鼠的附睾精子与生物素共孵育16小时后，通过链霉亲和素 pulldown 和质谱分析，鉴定出24种CFAP91邻近蛋白，其中EFCAB5和CFAP91的肽段数量最为丰富。此外，还检测到了RS3蛋白CFAP251和AKAP14，以及RS1/2蛋白RGS22。

EFCAB5在小鼠睾丸中特异性高表达，在人类精子中也存在，且在Cfap91敲除精子中完全缺失。系统进化分析显示EFCAB5在所有哺乳动物中都保守，但在节肢动物、衣藻和四膜虫中缺失，表明它是一个相对较新的进化产物。蛋白质分级分离证实EFCAB5与CFAP251、LRRC23一样存在于轴丝组分中。

EFCAB5 is vital for sperm motility

为了研究EFCAB5的功能，研究人员构建了Efcab5基因敲除小鼠。与Cfap91敲除不同，Efcab5敲除雄性小鼠仅表现为生育力轻微下降，精子形态正常，CFAP251和LRRC23的表达和定位也未受影响。然而，精子运动能力分析显示，敲除精子的运动性和前向运动比例显著降低，运动速度参数（VCL、VSL、VAP）下降，更重要的是，精子超活化（hyperactivation）特有的最大弯曲角度（α-angle）在 capacitation 后未能正常增加。

结构预测表明EFCAB5具有EF-hand钙结合域，可能感知钙离子信号。然而，体外实验发现EFCAB5与RGS22的结合不依赖于钙离子浓度，表明它们的结合是组成性的，可能为RS2和RS3之间提供稳定的连接。

本研究通过多种技术手段揭示了CFAP91在精子RS3组装中的核心作用：作为支架蛋白招募CFAP251等组分进入正在组装的轴丝。CFAP91的缺失会导致RS3组装失败，进而引起鞭毛形成障碍和男性不育。研究还创新性地应用邻近标记技术，在成熟精子中鉴定出精子特异的RS3组分EFCAB5，并证明其虽然不影响鞭毛组装，但对精子运动调节特别是超活化过程至关重要。

这些发现不仅深化了对精子轴丝组装和运动调控机制的理解，而且为男性不育的诊断和治疗提供了新的分子靶点。CFAP91和EFCAB5的突变都可能导致人类男性不育，未来的研究可以探索这些基因作为临床诊断标志物的潜力，并为相关不孕症开发新的治疗策略。