个性化基因组学策略显著提升遗传性视网膜病变诊断率：整合WES重分析、WGS与功能验证的多模态研究

本研究针对遗传性视网膜病变(IRD)诊断率低的临床难题，创新性地采用个性化分步策略对101例未确诊病例进行再评估。通过整合WES重分析、定制化基因panel、WGS和功能验证等技术，成功将诊断率提高48.5%，发现包括ABCA4深内含子变异在内的新型致病突变，为精准诊疗和基因治疗筛选奠定基础。该研究发表于《Eye》杂志，为IRD诊疗提供了标准化流程范本。

　　

遗传性视网膜病变(IRD)是一组威胁视力的遗传性疾病，尽管全外显子测序(WES)已成为标准诊断工具，但约40%病例仍无法确诊。这主要由于WES在检测非编码区变异、结构变异(SV)和复杂重排方面存在局限，同时大量意义未明变异(VUS)也阻碍临床决策。更棘手的是，视网膜组织难以获取使得功能验证困难，而新兴研究表明以往认为良性的同义变异和低表达变异也可能致病。这些挑战使得IRD患者难以获得精准诊断，进而影响基因治疗机会和遗传咨询质量。

为突破这些瓶颈，来自Bellvitge大学医院的研究团队开展了一项创新性研究。他们从597例确诊IRD患者中筛选出101例未确诊病例，采用个性化、分步式策略进行系统再评估。研究团队首先根据临床特征和遗传线索对病例进行优先级排序，随后通过多模态方法组合：包括变异重新分类、WES数据重分析（使用更新版虚拟panel和表型驱动分析）、定制化ABCA⁴/RPGR-ORF15 panel测序、全基因组测序(WGS)以及mRNA分析和迷你基因功能验证等实验手段。这种灵活的策略设计既考虑了成本效益，又能针对不同病例的特定需求选择最优技术组合。

关键技术方法包括：1) 对101例未确诊IRD患者进行临床和遗传特征分析；2) 采用Datagenomics软件和VarSeq平台进行WES重分析及CNV检测；3) 使用Illumina NovaSeq 6000平台进行WGS，通过CNAG GPAP和Emedgene平台分析；4) 针对ABCA⁴深内含子和RPGR-ORF15重复区域设计定制panel；5) 通过SpliceAI预测和体外剪接实验验证非编码变异功能影响。

研究结果

诊断率提升路径

通过系统评估，研究团队成功在49例(48.5%)先前未确诊病例中确立分子诊断。其中18例通过VUS重新分类解决，16例通过WES重分析发现，5例通过定制ABCA⁴/RPGR panel检出，10例通过WGS确诊。

值得注意的是，WGS在检测结构变异方面展现出独特优势，如发现PDE6B基因纯合缺失和NPHP1大片段缺失等WES易漏检的变异类型。

非编码变异致病机制

研究揭示了深内含子变异在IRD中的重要作用。如在P434病例中，WGS发现新型ABCA⁴ c.859-442C>T变异，剪接实验证实其导致三种异常转录本：238nt假外显子插入(37%)、外显子8-10跳跃(35%)和外显子8单独跳跃(7%)，最终被归类为中度严重变异。类似地，ATF6 c.160-8A>G变异通过mRNA分析证实引起7nt内含子序列插入，导致移码和提前终止密码子。

临床意义与意外发现

研究不仅提高诊断率，还带来重要临床启示。在P435和P436兄妹中，发现NPHP4双等位基因剪接位点变异(c.2485+2T>C和c.2611+1G>A)，确诊为Senior-L?ken综合征，并意外发现其中一人存在未被识别的肾脏受累。此外，通过等位基因分离分析纠正了最初误判，如P423和P430病例中，证实ABCA⁴变异实际为顺式排列，促使研究者发现反式深内含子变异而最终确诊。

讨论与结论

这项研究证实，个性化、多模态基因组学策略可显著提高IRD诊断率。其核心价值体现在三个方面：首先，强调定期WES重分析的重要性，特别是对单等位基因突变病例，间隔18-24个月的重分析能利用最新基因发现和变异解读知识；其次，证实WGS作为二线检测的价值，尤其对结构变异和非编码区变异的检出优势；最后，通过功能验证解决VUS分类难题，如建立ABCA⁴深内含子变异致病性判断标准。

研究还提出实用诊断流程建议：1) 对携带单 pathogenic variant的ABCA⁴或USH2A病例应优先评估深内含子变异；2) 临床表型与基因型不符时需考虑SV可能性；3) 转录本注释更新可揭示原先遗漏的致病变异。这些发现不仅指导临床实践，也为基因治疗试验的受试者筛选提供依据。

该研究的创新性在于将多种技术有机整合，针对不同遗传挑战采取定制化解决方案。例如，针对RPGR-ORF15区域开发的定制panel，相比长读长测序更具成本效益。未来，随着长读长测序技术的普及和ACMG-AMP指南的持续更新，IRD诊断率有望进一步提升。这项研究为实施视网膜疾病的精准医疗提供了重要范式，其方法论也可拓展至其他遗传性疾病的诊断领域。