UPF1快速耗竭揭示NMD调控人类转录组的时序动态图谱

本研究通过构建内源性UPF1条件性降解标签的人源细胞系，结合时间分辨转录组学、长读长测序和核糖体图谱技术，系统绘制了NMD调控的人类转录组全景图谱（NMDRHT）。研究发现UPF1主要调控选择性剪接（AS）介导的NMD靶向转录本，并揭示了非经典NMD事件的分子特征。该研究为理解UPF1在RNA质量控制中的作用提供了高分辨率数据资源（https://nmdrht.uni-koeln.de），对遗传性疾病和癌症研究具有重要意义。

　　

在真核生物中，维持转录组保真度对细胞功能至关重要。无义介导的mRNA降解（Nonsense-Mediated mRNA decay, NMD）作为一种关键的翻译依赖性RNA质量控制机制，可识别并降解含有提前终止密码子（Premature Termination Codons, PTCs）的异常mRNA。这一过程由核心因子UPF1介导，其不仅参与RNA降解，还调控基因表达。然而，UPF1在人类细胞中的必需性限制了其功能研究，传统基因敲除会导致细胞死亡，而RNA干扰策略又存在效率低、脱靶效应明显等问题。因此，开发高效、特异的UPF1耗竭方法，并解析其直接调控的转录本，对理解NMD的分子机制和生理功能具有重要意义。

在这项发表于《Molecular Cell》的研究中，Volker Boehm等研究人员通过构建内源性UPF1条件性降解细胞系，结合多组学技术，首次在时间维度上解析了UPF1调控的转录组动态变化，并建立了NMD调控的人类转录组图谱（NMD-Regulated Human Transcriptome, NMDRHT）。

研究主要采用了以下几种关键技术方法：1）利用auxin（AID）和dTAG两种诱导型降解系统实现UPF1蛋白的快速可逆耗竭；2）应用SLAM-seq（Thiol-linked alkylation for the metabolic sequencing of RNA）技术监测mRNA合成与降解动力学；3）整合Oxford Nanopore和PacBio长读长测序数据构建高质量转录本注释；4）通过Ribo-seq（核糖体图谱）分析翻译组变化；5）采用质谱蛋白质组学检测NMD靶向蛋白异构体的表达。样本来源于人结直肠癌细胞系HCT116和人胚胎肾细胞系HEK293。

研究结果主要包括以下方面：

Rapid depletion of UPF1 via the AID system inhibits NMD

研究人员成功构建了N端和C端带有AID降解标签的UPF1细胞系。实验表明，加入auxin（IAA）后2小时内即可有效降解UPF1蛋白，并导致已知NMD靶标（如SRSF2、ZFAS1和GAS5）的快速积累。与传统的RNA干扰相比，降解系统能更快速、更特异地抑制NMD活性。

Identification and characterization of UPF1-regulated genes

通过时间分辨转录组分析，发现UPF1耗竭后上调的基因可划分为“早期”、“延迟”和“晚期”响应簇。早期和延迟响应基因富集于经典的NMD靶标，而晚期变化可能源于间接效应。进一步通过NMD相关性分析证实，UPF1直接调控的转录本主要参与NMD通路。

UPF1 destabilizes target mRNAs and is not required for HMD

SLAM-seq动力学分析表明，UPF1耗竭导致927-1053个基因的mRNA稳定性增加，证实UPF1通过促进靶标mRNA降解发挥功能。值得注意的是，UPF1耗竭并不影响组蛋白mRNA降解（Histone mRNA Decay, HMD），表明UPF1在不同RNA降解通路中具有特异性。

Defining the NMDRHT

研究整合54个转录组数据集，构建了包含45,747个转录本的NMDRHT注释。该注释发现约18%的转录本含有NMD激活特征（符合50-nt规则），其中三分之一为新型内含子链结构。通过ORF注释和核糖体图谱验证，发现选择性剪接（AS-NMD）是主要的NMD激活机制。

UPF1 regulates primarily alternatively spliced NMD-targeted transcripts

转录本水平的差异表达分析显示，NMD敏感的转录本异构体在UPF1耗竭后显著上调。AS-NMD转录本表现出最强的响应，而含有上游开放阅读框（uORFs）的混合型转录本响应较弱。研究还发现许多新型转录本异构体也受UPF1调控。

Investigation of non-canonical UPF1-regulated transcripts

对不符合50-nt规则但仍受UPF1调控的转录本进行分析，发现其3' UTR长度与经典NMD靶标无显著差异，但具有更高的二级结构稳定性。然而，这些转录本的表达变化与已知的UPF1依赖性降解通路（如SMD、RMD、SRD）无显著关联，提示可能存在新型调控机制。

Cellular proteome changes upon UPF1 depletion

蛋白质组学分析发现，尽管NMD靶向转录本显著上调，但其编码的蛋白异构体仅少量被检测到（仅177种肽段）。这些肽段主要来源于剪接因子（如SRSF3、SRSF11）和核糖体蛋白（如RPL3），其积累可能导致功能结构域破坏和细胞稳态失衡。

研究结论与讨论部分强调，本研究通过时间分辨的UPF1耗竭系统，揭示了NMD靶向转录本的动态调控网络。研究发现UPF1主要通过调控选择性剪接产生的NMD靶标维持转录组稳态，而非经典降解通路的作用相对有限。建立的NMDRHT图谱为研究NMD相关疾病（如遗传性疾病和癌症）提供了重要资源。该研究还提出，长时间UPF1耗竭会导致大量间接效应，说明急性降解系统在解析直接功能中的优势。最后，作者指出未来研究需要进一步探索UPF1在非经典降解通路中的作用，以及其在细胞类型特异性调控中的差异。