BRCA1缺陷细胞中染色质富集的RAD51成为靶向治疗新策略

本研究针对BRCA1突变肿瘤PARP抑制剂耐药机制不明确的难题，通过蛋白质组学筛选发现MDC1和53BP1在BRCA1缺陷细胞中共同富集于染色质。研究人员首次揭示RAD51以非焦点形式在染色质上富集并成为维持细胞生存的关键依赖因子，而MDC1或H2AX缺失虽能恢复复制间隙抑制（RGS）并诱导PARPi耐药，却无法恢复RAD51电离辐射诱导焦点（IRIF）。该发现颠覆了传统同源重组修复（HR）主导PARPi敏感性的认知，为RAD51抑制剂治疗提供了新靶点。

　　

在肿瘤治疗领域，BRCA1突变癌症对PARP抑制剂（PARPi）的高度敏感性曾被认为是同源重组修复（HR）缺陷的直接结果。传统观点认为，无法形成RAD51焦点（IRIF）标志着HR功能丧失，从而导致DNA双链断裂（DSB）修复障碍。然而，临床中发现部分BRCA1缺陷肿瘤会产生PARPi耐药性，且这种耐药性与53BP1缺失介导的HR功能恢复密切相关，这使得研究人员开始重新审视PARPi敏感性的真正机制。

近年来，单链DNA（ssDNA）复制间隙被证实是BRCA1缺陷细胞的另一重要特征。这些间隙与PARPi敏感性密切相关，甚至当HR恢复时，通过抑制间隙修复仍可重新获得PARPi敏感性。这一发现提示，复制间隙抑制（RGS）可能独立于HR通路影响治疗反应。为了厘清HR和RGS在PARPi响应中的各自作用，研究人员迫切需要找到能特异性调控其中某一通路的因子。

针对这一科学问题，Sharon B. Cantor团队在《Molecular Cell》发表了最新研究成果。他们通过系统性研究首次揭示：在BRCA1缺陷细胞中，RAD51以非焦点形式富集于染色质，这种特殊状态竟成为维持细胞生存的关键依赖因素；而MDC1或H2AX的缺失虽能通过抑制复制间隙诱导PARPi耐药，却意外地无法恢复RAD51焦点形成。这一发现彻底颠覆了传统认知，为理解BRCA缺陷肿瘤的治疗响应机制提供了全新视角。

研究人员主要采用了几项关键技术：通过稳定同位素标记（SILAC）质谱技术进行染色质结合蛋白组学筛选；利用DNA纤维拉伸技术（DNA fiber combing）结合S1核酸酶处理检测复制间隙；采用邻近连接技术（PLA）分析蛋白质相互作用和染色质结合状态；通过免疫荧光分析评估RAD51焦点形成和蛋白定位；使用克隆形成实验和细胞活力测定评估药物敏感性。

研究结果首先显示，MDC1具有53BP1依赖的染色质富集特征。通过SILAC质谱比较BRCA1缺陷细胞与野生型细胞的染色质蛋白组，研究人员发现MDC1与已知的53BP1同样在BRCA1缺陷细胞中显著富集。这种富集在多种细胞模型中得到验证，包括人源RPE1细胞、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和BRCA1突变乳腺癌细胞系MDA-MB-436。重要的是，MDC1的富集完全依赖于53BP1的存在。

MDC1缺失可介导PARP或TLS抑制剂耐药。与53BP1缺失类似，敲低MDC1能够显著增强BRCA1缺陷细胞对PARPi和TLS抑制剂（TLSi）的抵抗能力，而不影响细胞基础活力。这种耐药表型在多个细胞系统中得到一致验证，表明MDC1与53BP1在功能上具有相似性。

MDC1缺失可减少BRCA1缺陷细胞的复制间隙。通过DNA纤维分析发现，MDC1缺陷能够像53BP1缺失一样抑制S1核酸酶敏感的复制 tract 缩短，表明复制间隙减少。同时，MDC1缺失还降低了S期PAR水平和染色质结合的RPA量，进一步证实了间隙抑制的表型。更重要的是，在MDC1/BRCA1双敲除细胞中，LIG3的缺失能够重新恢复PARPi敏感性，这与53BP1缺失模型中的发现完全一致。

MDC1在整个细胞周期中持续存在于染色质。通过邻近连接 assay（PLA）技术，研究人员发现MDC1与PCNA在复制叉处存在近距离相互作用，且在BRCA1缺陷细胞中，这种相互作用显著增强。更有趣的是，MDC1还与ssDNA存在特异性结合，且这种结合在BRCA1缺陷细胞中尤为明显。多变量定量分析进一步证实，MDC1在BRCA1缺陷细胞的整个细胞周期中都保持染色质富集状态。

MDC1和53BP1的染色质富集依赖于H2AX。研究发现，MDC1和53BP1在BRCA1缺陷细胞中的染色质定位存在相互依赖关系，且两者都严格需要H2AX的存在。敲低H2AX能够显著减少MDC1和53BP1的染色质结合，并同时诱导PARPi和TLSi耐药，表明这三者形成了一个功能协同的染色质调控网络。

与53BP1缺失不同，MDC1或H2AX缺失无法恢复RAD51 IRIF。尽管MDC1或H2AX缺失能够诱导PARPi耐药，但它们都无法恢复BRCA1缺陷细胞中的RAD51焦点形成。这一关键发现首次将PARPi耐药性与RAD51焦点形成完全解耦，挑战了HR恢复是PARPi耐药唯一机制的传统观点。

53BP1、MDC1或H2AX缺失可逆转异常的RAD51染色质富集。通过染色质分级和免疫印迹分析，研究人员发现BRCA1缺陷细胞中存在显著的RAD51染色质富集，而这种富集在53BP1、MDC1或H2AX缺失时都被有效抑制。值得注意的是，这种RAD51染色质富集状态在多个PARPi敏感的BRCA1缺陷模型中都得到验证，包括人源癌细胞系和小鼠肿瘤模型。

RAD51染色质富集发生于复制后阶段且依赖于PALB2。通过时间分辨的PLA实验，研究人员发现RAD51在BRCA1缺陷细胞中的染色质加载主要发生在复制后阶段，而不是在活跃的复制叉上。更重要的是，这种加载过程依赖于HR介质蛋白PALB2，而不依赖于BRCA2。PALB2的缺失会特异性破坏RAD51染色质结合，同时进一步增强PARPi敏感性，这与MDC1缺失的表型形成鲜明对比。

染色质富集的RAD51凸显其在BRCA1缺陷细胞中的必要性。使用RAD51抑制剂（B02或RI-1）处理发现，BRCA1缺陷细胞对RAD51抑制高度敏感，而这种敏感性在53BP1或MDC1缺失的细胞中被显著削弱。联合TLS抑制剂处理能够进一步增强RAD51抑制剂的杀伤效果，表明RAD51和TLS在间隙处理中发挥着互补而非冗余的功能。

研究结论与讨论部分指出，这项工作从根本上重新定义了我们对BRCA1缺陷细胞治疗响应机制的理解。传统上认为PARPi敏感性源于HR缺陷导致的DSB修复障碍，而耐药性则来自HR功能恢复。本研究却发现，RAD51在BRCA1缺陷细胞中并非失去功能，而是被"征用"到染色质上处理复制间隙，这种非经典的染色质富集状态反而成为细胞生存的关键依赖。

更重要的是，研究发现MDC1、H2AX和53BP1形成了一个染色质水平的调控网络，共同管理着BRCA1缺陷细胞中的复制动态和间隙形成。这些蛋白不再仅仅是DNA损伤的"标志物"，而是主动参与塑造复制景观、暴露治疗脆弱性的"调控者"。这一发现为针对复制间隙的治疗策略提供了坚实理论基础。

研究的另一重要突破在于揭示了RAD51 exhaustion（耗竭）模型：当RAD51被大量招募到全基因组的间隙位点时，其可用于其他功能（如DSB修复）的"自由池"就会严重不足。这完美解释了为何BRCA1缺陷细胞中同时存在RAD51染色质富集和IRIF形成缺陷的表型。

从转化医学视角来看，这项工作具有重要临床意义。它提示RAD51抑制剂可能特别适用于具有间隙脆弱性的癌症，而不仅仅是那些HR缺陷的肿瘤。同时，研究还表明肿瘤中高水平的RPA或RAD51可能反映的是更活跃的间隙保护/修复过程，而非更强的DSB修复能力，这为生物标志物开发提供了新思路。

总之，这项研究不仅深化了我们对BRCA1生物学功能的理解，更重要的是为治疗策略开发提供了新方向。通过靶向复制间隙处理通路而非传统的DSB修复通路，可能能够更精确地攻击癌细胞的脆弱性，最终改善BRCA突变癌症患者的治疗效果。