整合空间转录组解析肿瘤相关三级淋巴结构的细胞特征及其在免疫治疗中的意义

Cell Reports期刊推荐：为解决肿瘤相关三级淋巴结构（TA-TLS）形成与成熟机制不清的问题，研究人员通过整合23种癌症的空间转录组数据，构建了首个泛癌TA-TLS图谱，揭示了成熟TA-TLS中IgG+浆细胞富集、CCL19+血管周细胞（PvCs）作为淋巴组织组织者（LTo）细胞的关键作用，以及动脉内皮细胞（ECs）通过Notch信号抑制获得高内皮微静脉（HEV）样表型的转化潜能。该研究为靶向TLS的癌症免疫治疗提供了新策略。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，三级淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structures, TLS）作为肿瘤微环境中的特殊免疫细胞聚集区，近年来备受关注。这些结构通常与更好的淋巴细胞浸润、患者预后及免疫检查点抑制剂治疗效果相关。然而，TLS的形成机制、细胞组成及其功能状态在不同肿瘤类型中的异质性尚未明确。特别是在人类癌症中，驱动TLS生成的特定细胞成分以及影响其成熟的关键因素仍知之甚少。传统低通量技术如免疫荧光染色难以全面解析TLS的复杂细胞架构，而单细胞测序技术虽能揭示细胞异质性，却破坏了空间信息。因此，利用新兴的空间转录组学技术，系统性地研究肿瘤相关TLS（TA-TLS）的细胞特征和空间组织，对于理解其生物学功能及开发靶向治疗策略具有重要意义。

为了深入探究TA-TLS的细胞组成和空间结构，研究人员开展了一项跨23种癌症类型的整合性研究。该研究利用了10X Visium平台的空间转录组数据，避免了技术差异，并提供了全转录组范围的基因表达谱。通过对477张肿瘤空间转录组切片进行分析，研究人员手动注释了517个TA-TLS区域，并根据成熟状态将其分为淋巴细胞聚集（LA）、初级滤泡样TLS（PFL）和次级滤泡样TLS（SFL）。通过多重免疫组化（mIHC）验证，证实了转录组与蛋白表达的一致性。研究还结合单细胞转录组数据，揭示了TA-TLS中不同细胞类型的转录特征和空间分布，并通过体外实验验证了关键发现。

研究主要采用了以下关键技术方法：空间转录组学（10X Visium）用于全转录组空间表达分析；单细胞RNA测序（scRNA-seq）用于细胞亚型鉴定；多重免疫组化（mIHC）用于蛋白水平验证；伪时间轨迹分析（Monocle）用于细胞状态转变研究；以及qPCR实验用于基因表达验证。样本来源包括公共数据集和6例新采集的临床样本（肝细胞癌和胃腺癌）。

Landscape of TA-TLSs revealed by spatial transcriptomics

研究人员收集了26种癌症类型的477张空间转录组切片，通过逐步注释策略，基于经典标记基因表达和淋巴细胞分布模式，识别出517个TA-TLS区域，包括317个LA、78个PFL和122个SFL。这些TA-TLS主要来自肝细胞癌、肾透明细胞癌、前列腺癌等癌症类型。通过主成分分析（PCA），发现不同成熟状态的TLS在基因表达上存在明显分离，SFL中滤泡树突状细胞（FDC）标记基因（如FCER2和CR2）和B细胞标记基因（如CD79A、CD19和MS4A1）表达最高。同时，细胞因子（如CCL19、CCL21和CXCL13）的表达随TLS成熟而增加，这与它们促进淋巴细胞聚集和TLS形成的功能一致。空间聚类分析将23,641个点注释为7个不同的生态位，包括内皮细胞富集点、T和B细胞富集点、FDC富集点等。随着TLS成熟，T&B和FDC富集点的比例增加，且FDC富集点最接近TLS中心，符合已知的TLS结构。此外，SFL表现出更低的恶性细胞浸润程度，且SFL特异性基因特征在多种癌症类型中与良好的临床结果相关。

B cells tend to mature into IgG-producing plasma cells in mature TA-TLSs

研究发现，含有生发中心（GC）的TLS与多种癌症类型的临床益处相关。通过无监督聚类，将T&B富集点进一步分为B富集和T富集亚群。空间分析显示，在PFL和SFL中，B富集点主要位于TLS中心附近，而非LA中。B富集点的比例从LA的16.7%增加到SFL的41.7%，表明SFL是B细胞克隆扩张的场所。转录组分析发现，CXCL13及其受体CXCR5与B细胞丰度呈正相关，VPREB3在GC B细胞中高表达，FDC相关基因（CR1、CR2和FDCSP）随B细胞聚集而上调。此外， mural细胞（血管周细胞）标记基因也与B细胞扩张正相关。浆细胞富集点在SFL中更接近TLS边缘，且CXCL12表达与距离正相关，表明SFL具有向外输送浆细胞的能力。在抗体类型偏好上，LA中IgG和IgA平衡，而PFL和SFL中IgG占主导，提示成熟TLS促进B细胞向IgG产生型浆细胞分化。

CCL19+ PvCs are associated with TA-TLS formation

研究关注间充质细胞（MC）富集点的异质性，通过聚类识别出两个亚群：C1高表达CCL19和T细胞相关基因TRAC，且更接近T富集点，类似于纤维网状细胞（FRC）；C0高表达mural细胞标记基因（如MYH11和ACTA2），位于TLS边缘，类似于边缘网状细胞（MRC）。结合单细胞转录组数据，发现mural细胞包括C0-周细胞（RGS5⁺）、C1-平滑肌细胞（SMC，MYH11⁺）和C2-CCL19⁺ PvCs。C2-CCL19⁺ PvCs特异性表达CCL19和CCL21，以及细胞粘附和T细胞激活相关基因，并通过mIHC验证其存在于CD31⁺内皮细胞周围，且不同于经典的PDPN⁺癌症相关成纤维细胞（CAF）。整合空间转录组数据显示，MYH11⁺CCL19⁺ PvCs形成血管周围单层结构，靠近淋巴细胞富集区。mIHC显示，CCL19⁺区域附近CD20⁺ B细胞聚集更多，且细胞尺寸更大。这些细胞响应TNF和NF-κB信号，类似于淋巴组织组织者（LTo）细胞，且其基因特征与TLS评分在TCGA数据中正相关。

Arterial ECs within TA-TLSs exhibit HEV-like transformation potential

研究发现，内皮细胞（EC）在控制免疫细胞从循环系统进入肿瘤微环境中起关键作用。在SFL的EC富集点中，淋巴细胞招募细胞因子（CCL19、CCL21、CXCL9和CXCL13）表达上调，而单核/巨噬细胞招募细胞因子（CCL2、CCL4、CCL5）和粘附分子（ICAM1、ICAM2、ICAM3）变化较小。通过聚类，EC富集点分为静脉EC（ACKR1⁺）、HEV样EC和动脉EC（GJA5⁺）。HEV样点高表达LTB和淋巴细胞基因，且周围有更多T&B富集点。动脉EC在TLS内上调白细胞趋化相关基因，伪时间轨迹显示动脉EC可向HEV样点分化，伴随动脉标记基因（GJA4/5、SEMA3G、FBLN5）下调、粘附相关基因（ICAM1、ICAM3、MADCAM1、SELP）上调。NOTCH信号通路与分支1负相关，NOTCH1表达下调。体外实验用Notch抑制剂crenigacestat处理小鼠主动脉内皮细胞（MAEC），qPCR显示Notch1、Dll4、Efnb2等动脉标记基因下调，而Madcam1、Sele、Selp等HEV标记基因上调，证实NOTCH信号抑制可诱导动脉EC向HEV样表型转化。

DISCUSSION

研究通过空间转录组技术，克服了单细胞技术破坏空间结构的限制，构建了泛癌TA-TLS图谱，揭示了成熟状态特异的细胞组成、空间分区和转录程序。研究发现CCL19⁺ PvCs作为一种LTo细胞，参与淋巴细胞招募；动脉EC通过NOTCH1抑制获得HEV样表型，增强免疫招募能力；成熟TLS倾向于产生IgG⁺浆细胞。这些发现为靶向TLS的免疫治疗提供了新靶点，如促进TLS新生和HEV诱导。研究局限性包括空间转录组分辨率不足，未来需结合高分辨率技术、纵向数据及多组学整合进一步验证。

总之，该研究系统解析了TA-TLS的细胞特征和空间组织，揭示了CCL19⁺ PvCs和动脉EC转化在TLS形成和功能中的关键作用，为改善癌症免疫治疗策略提供了重要理论基础和潜在靶点。论文发表于《Cell Reports》，对推动肿瘤免疫微环境研究具有重要意义。