细菌膜电位干扰毒素Ptx2的冷冻电镜结构揭示VI型分泌系统效应蛋白的作用机制

本刊推荐：为揭示VI型分泌系统(T6SS)介导的膜电位干扰毒素作用机制，研究人员通过冷冻电镜解析了铜绿假单胞菌H2-T6SS分泌的Ptx2毒素三维结构（分辨率3.3?），发现其独特的结构域构象和膜插入激活机制，并证实胞外单价阳离子是毒性必需因素。该研究首次呈现VasX家族效应蛋白的分子结构，为开发新型抗菌策略提供理论基础。

　　

在微生物世界的残酷竞争中，细菌演化出了精密的分子武器系统来对抗邻近细胞。其中，VI型分泌系统（Type VI Secretion System, T6SS）作为革兰氏阴性菌特有的"分子注射器"，能够直接将毒性效应蛋白注入竞争对手或宿主细胞内。这些效应蛋白通过破坏细胞分裂、代谢通路或细胞包膜完整性等多种机制导致靶细胞死亡。在众多T6SS效应蛋白中，有一类特殊的膜电位干扰毒素，它们通过在细胞膜上形成离子通道来耗散质子动力势（Proton Motive Force, PMF），从而破坏细胞的能量代谢体系。

尽管VasX家族毒素作为膜电位干扰效应蛋白的代表已被发现多年，但其分子结构和具体作用机制始终是未解之谜。这类毒素如何从可溶性状态转变为膜嵌入状态？它们如何选择性地传导离子？相应的免疫蛋白又如何中和其毒性？这些问题一直困扰着微生物学家。为了解决这些基础性问题，研究人员对铜绿假单胞菌PA14菌株的H2-T6SS分泌的Ptx2毒素展开了系统研究。

本研究主要采用了冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术解析Ptx2的三维结构，结合AlphaFold3蛋白质结构预测进行构象比对，通过基因敲除和点突变构建系列菌株验证功能域，利用细菌竞争实验和生长曲线分析毒性特征，采用蛋白质共纯化技术验证蛋白-蛋白相互作用，并开展生物信息学分析鉴定同源蛋白和保守结构域。

研究结果

Ptx2从细菌周质发挥功能

通过将Ptx2靶向至大肠杆菌周质空间，研究人员发现其能够强烈抑制细菌生长，而胞质表达则无毒性。进一步利用铜绿假单胞菌Δpti2突变株（缺失Ptx2免疫蛋白）的实验表明，该菌株在固体培养基上生长受损，而在液体培养或T6SS失活条件下生长正常，证实Ptx2确实在周质空间发挥毒性作用。

Ptx2破坏PMF的电势组分

研究人员通过改变培养基离子组成发现，Ptx2的毒性依赖于胞外单价阳离子（钠或钾离子），在仅含蔗糖作为渗透保护剂的培养基中毒性消失。在不同pH条件下的实验显示，碱性条件（pH 9.0）增强Ptx2毒性，而酸性条件（pH 5.0）则完全抑制其活性，表明Ptx2主要破坏PMF的电势组分（ΔΨ）而非质子梯度（ΔpH）。

可溶性Ptx2的冷冻电镜结构

通过单颗粒冷冻电镜技术，研究人员解析了Ptx2的3.3?分辨率结构，发现该蛋白呈延伸的碟形结构（11×7.5×4 nm），包含多个独特结构域：N端的MIX结构域（残基36-258）、支架结构域（残基259-816和963-999）、潜在的跨膜结构域（TMD，残基817-962）和C端免疫球蛋白样结构域。结构分析表明，在可溶性状态下，TMD的疏水残基被支架结构域包裹保护。

推定的TMD和动态柔性区对Ptx2毒性至关重要

AlphaFold3预测显示Ptx2的TMD可能形成延伸的 coiled-coil 结构暴露于溶剂中，与冷冻电镜结构中的埋藏状态形成鲜明对比。点突变实验证实，将TMD中的Met894或Ser898突变为赖氨酸会破坏Ptx2毒性。此外，研究人员发现一个柔性区域（FR，残基315-411）在可溶性状态下动态无序，而在与免疫蛋白Pti2复合时形成α-螺旋束，删除该区域会消除Ptx2毒性并破坏与Pti2的相互作用。

Ptx2的N端MIX结构域与其适配器蛋白Tap6结合

通过冷冻电镜二维分类和共纯化实验，研究人员证实Tap6与Ptx2的MIX结构域（残基32-163）直接相互作用。生物信息学分析发现，含有III和IV类MIX结构域的Ptx2同源蛋白通常与Tap蛋白共编码，而含有I类MIX结构域的同类蛋白则直接与VgrG spike蛋白相互作用，这表明MIX结构域作为N端识别模块通过不同机制招募效应蛋白至T6SS装置。

研究结论与意义

本研究首次揭示了VasX家族膜电位干扰毒素的分子结构，提出了Ptx2的作用机制模型：在产生菌胞内，Ptx2通过其MIX结构域与Tap6-VgrG6形成三元复合物；分泌至靶细胞后，其柔性区与细胞膜相互作用引发构象变化，使TMD从埋藏状态转变为延伸的膜插入状态，形成离子通道耗散PMF；当存在免疫蛋白Pti2时，其与柔性区结合阻止TMD的膜插入。

该研究的重要意义在于：首先提供了VasX家族效应蛋白的结构基础，为理解这类广泛存在的细菌竞争因子提供了分子框架；其次揭示了MIX结构域作为T6SS识别信号的作用机制，解释了效应蛋白的特异性招募原理；最后阐明了免疫蛋白通过结合毒素柔性区而非直接阻断孔道的中和机制，为开发新型抗菌策略提供了新思路。

尽管本研究取得了重要突破，但仍存在一些局限性：AlphaFold3预测的膜插入构象置信度有限，真实膜状态可能有所不同；Ptx2与Tap6互作的分子细节未能完全解析；Ptx2是形成单体还是寡聚通道尚不明确。未来通过脂质纳米盘或脂质体等技术研究膜嵌入状态的结构，将进一步完善对这类重要细菌毒素作用机制的理解。

这项发表于《Cell Reports》的研究不仅增进了我们对细菌竞争机制的认识，也为开发针对T6SS的新型抗菌治疗策略提供了理论基础，具有重要的科学价值和潜在的应用前景。