E3连接酶TRIP12动态调控氧化应激反应：通过延伸K29泛素链确保NRF2降解与应激沉默

本研究针对氧化应激反应中NRF2降解机制不明确的问题，揭示了E3连接酶TRIP12作为CUL3KEAP1的协同因子，通过延伸K29泛素链促进NRF2蛋白降解，动态调控抗氧化信号通路的激活与沉默。该发现为神经退行性疾病治疗提供了新靶点。

　　

细胞在应对活性氧（ROS）攻击时，会启动氧化应激反应来维持自身稳态。这一过程的核心是转录因子NRF2及其E3连接酶复合物CUL3^KEAP1。在正常状态下，CUL3^KEAP1通过泛素化降解NRF2，使其维持在低水平；而当ROS积累时，KEAP1的半胱氨酸残基被氧化，失去降解NRF2的能力，导致NRF2进入细胞核启动抗氧化基因表达。然而，当ROS被清除后，细胞需要快速恢复NRF2的降解以避免还原应激（reductive stress）和氧化性凋亡（oxeiptosis）。但这一动态转换的机制尚不明确。

近日，美国加州大学伯克利分校Michael Rape团队在《Cell Reports》发表研究，发现HECT家族E3连接酶TRIP12是调控这一过程的关键因子。TRIP12通过与CUL3^KEAP1结合，延伸K29连接的泛素链，从而增强NRF2的降解效率。这一机制不仅加速应激反应的沉默，还限制了应激期间NRF2的过度激活，表明抑制TRIP12可能延长NRF2介导的抗氧化信号，为治疗ROS相关疾病提供新策略。

研究团队运用了多种关键技术方法：通过RNA干扰筛选和细胞分化模型鉴定出CCNF和p62等基因在NRF2通路中的作用；利用免疫共沉淀与质谱分析揭示TRIP12与CUL3^KEAP1-NRF2复合物的相互作用；体外泛素化实验证实TRIP12催化K29泛素链延伸；细胞竞争实验和荧光显微术评估TRIP12缺失对细胞存活及NRF2核定位的影响；此外，还通过DepMap数据库分析基因相关性。

CCNF是成肌细胞氧化应激信号传导所必需的

研究人员在成肌细胞中发现，敲低KEAP1会阻碍细胞分化，而同时敲低CCNF则可恢复分化能力。RNA测序显示，CCNF缺失抑制了NRF2靶基因的表达，并逆转了KEAP1缺失导致的ROS降低。细胞竞争实验进一步表明，CCNF缺失消除了KEAP1抑制在氧化应激下的生存优势。

p62/SQSTM支持氧化应激信号传导

筛选发现，另一个肌萎缩侧索硬化（ALS）风险因子p62的缺失也能部分恢复KEAP1敲低细胞的分化，并限制NRF2靶基因的诱导。p62缺失同样削弱了KEAP1抑制带来的生存获益，表明其参与调控NRF2稳定性。

NRF2和CUL3^KEAP1结合E3连接酶TRIP12

Western blot分析显示，CCNF或p62的缺失阻止了KEAP1敲低引起的NRF2积累，且蛋白酶体抑制剂可恢复NRF2水平。通过质谱分析，研究人员发现NRF2与TRIP12存在相互作用，且TRIP12直接结合CUL3，这一结合在氧化应激下减弱。TRIP12作为HECT家族E3酶，在脑和肌肉中高表达，其突变与多种神经疾病相关。

TRIP12是CUL3^KEAP1的泛素链延伸因子

体外实验表明，CUL3^KEAP1与E2酶UBE2D3催化NRF2泛素化，但无法形成K29连接链。而TRIP12可特异性延伸K29泛素链，且这一过程依赖于其HECT结构域的催化半胱氨酸。当TRIP12与CUL3^KEAP1共同作用时，NRF2被修饰为高分子量聚合物，且K29链仅在TRIP12存在时被检测到。细胞实验证实，TRIP12缺失降低了NRF2的K29泛素化水平。

TRIP12限制NRF2积累

TRIP12的mRNA和蛋白水平在氧化应激时升高，并进入细胞核。敲低TRIP12增加了核内NRF2的积累，且与KEAP1敲低有叠加效应。此外，TRIP12缺失还促进了p62斑点的形成。在应激恢复期，TRIP12缺失显著延迟了NRF2的降解，表明其在应激沉默中起关键作用。

TRIP12限制氧化应激信号传导

尽管单独敲低TRIP12对NRF2靶基因影响较小，但在中度氧化应激下，TRIP12缺失显著增强了这些基因的诱导。恢复实验显示，TRIP12缺失细胞在应激后仍持续表达抗氧化基因，表明其调控应激反应的时效性。细胞竞争实验证明，TRIP12缺失提高了细胞在多种氧化应激下的生存率，且这一效应依赖于NRF2。

研究结论表明，TRIP12作为泛素链延伸因子，与CUL3^KEAP1协同确保NRF2的有效降解，从而动态调控氧化应激反应。这种机制使细胞能够在应激后快速恢复稳态，但代价是限制了应激期间的保护性信号。TRIP12的抑制可能为神经退行性疾病提供治疗机会，因其可增强NRF2活性而不易引发肿瘤。该研究不仅深化了对氧化应激响应动态平衡的理解，也为靶向TRIP12的治疗策略奠定了理论基础。