细胞周期抑制蛋白CDKN1A介导Cx3cr1-Cre工具小鼠品系依赖性及命运依赖性的细胞反应

为解决Cx3cr1CreERT2工具小鼠在不同研究中出现矛盾结果的问题，研究人员开展了两大品系（Litt与Jung）的对比研究，发现他莫昔芬（TAM）处理可导致Cx3cr1CreERT2(Litt)小鼠小胶质细胞中CDKN1A（p21）持续高表达，进而引起细胞周期阻滞、增殖能力下降及异常反应，而Cx3cr1CreERT2(Jung)小鼠无此现象。该研究提示使用Cx3cr1CreERT2工具鼠时需谨慎选择品系，避免CDKN1A依赖性表型干扰。

　　

在神经科学领域，小胶质细胞作为中枢神经系统（CNS）中常驻的免疫细胞，其功能与机制研究高度依赖于遗传工具鼠。其中，他莫昔芬（TAM）诱导的Cx3cr1^CreERT2小鼠被广泛用于特异性操控小胶质细胞及其他Cx3cr1阳性髓系细胞。然而，不同实验室使用该工具鼠时，常得出相互矛盾的结果，例如在小胶质细胞再生动力学和行为学表现等方面存在显著差异。尤其令人困惑的是，近年有研究指出，在发育早期使用Cx3cr1^CreERT2小鼠可能导致小胶质细胞出现异常反应，但具体机制不明。这些矛盾结果严重阻碍了研究的可靠性与可重复性，因此，系统比较不同Cx3cr1^CreERT2品系的特性并揭示其潜在机制，成为亟待解决的重要问题。

为此，研究人员在《Cell Reports》上发表了他们的研究成果。他们聚焦于两个最常用的Cx3cr1^CreERT2小鼠品系——Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}（Jax #021160）和Cx3cr1^{CreERT2(Jung)}（Jax #020940），开展了一系列严谨的对比研究。为了探究这两个品系在TAM处理后的反应，研究团队运用了多种关键技术方法。他们利用他莫昔芬（TAM）对成年及 postnatal day (P)1/P3 的幼鼠进行诱导处理。通过流式细胞术（FACS）分选脑组织中的小胶质细胞和肾脏巨噬细胞等进行后续分析。在分子机制探索层面，他们采用了bulk RNA测序（RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）来全面解析转录组变化；通过染色质转座酶可及性测序（ATAC-seq）和CUT&Tag（用于H3K27ac）技术来研究表观遗传状态的改变；并辅以基因组测序验证转基因插入位点。在功能研究上，他们使用了小胶质细胞清除与再增殖模型（采用CSF1R抑制剂BLZ945），并通过免疫组织化学（IHC）和细胞周期分析（EdU, pH3染色）等手段在体评估小胶质细胞的形态、数量、增殖和凋亡情况。此外，还使用了CDKN1A抑制剂UC2288进行功能挽救实验。

A mouse line-dependent induction of Cdkn1a in Cx3cr1CreERT2 microglia

研究人员首先对成年小鼠进行比较。组织学分析显示，无论是Cx3cr1^{CreERT2(Jung)}还是Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}品系，TAM处理均未引起IBA1⁺小胶质细胞数量和形态的显著改变。然而，bulk RNA-seq分析揭示了一个关键差异：与玉米油处理的对照组相比，TAM处理的Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}小鼠小胶质细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（Cdkn1a，也称为p21）的表达被特异性且显著地上调，而Cx3cr1^{CreERT2(Jung)}小鼠中则无此变化。qPCR证实Cdkn1a的上调在Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}小胶质细胞中持续存在，直至TAM处理后3个月才恢复基线水平。这种诱导不仅限于小胶质细胞，也见于其他Cx3cr1阳性的髓系细胞，如中枢神经系统边界相关巨噬细胞（BAMs）和肾脏巨噬细胞。scRNA-seq分析表明，Cdkn1a的表达增加是随机的、细胞固有的现象，而非特定小胶质细胞状态的结果。进一步机制探讨排除了DNA损伤（γH2AX染色阴性）和细胞衰老（SA-β-gal活性未增加）是Cdkn1a持续诱导的主要原因。表观遗传学分析发现，在TAM处理的Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}小胶质细胞中，Cdkn1a基因位点的组蛋白H3K27乙酰化（H3K27ac）水平和染色质可及性均显著增加，提示表观遗传修饰参与了其持续激活。基因组测序未发现Cdkn1a基因座或Cx3cr1位点CreERT2转基因存在可能解释上述现象的DNA变异。

Enhanced CDKN1A expression alters microglial responses in adult Cx3cr1CreERT2(Litt) mice

鉴于CDKN1A是细胞周期的负调控因子，研究人员推测其高表达可能会损害小胶质细胞的增殖潜能。他们利用小胶质细胞清除（使用BLZ945）后再增殖的模型来验证这一假设。当在增殖期给予成年Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}小鼠TAM时，其小胶质细胞在基因表达上仅呈现微小变化，但Cdkn1a仍显著上调，并通过免疫染色证实了CDKN1A蛋白水平的增加。更重要的是，与对照组相比，TAM处理的Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}小鼠小胶质细胞的再生能力明显受损，细胞密度恢复缓慢。流式细胞术显示这些细胞具有更大的细胞尺寸和内部复杂性，核形态也出现异常。相反，Cx3cr1^{CreERT2(Jung)}小鼠的小胶质细胞则未出现这些变化，再生正常。即使是在TAM处理4周后（此时Cdkn1a表达仍升高）再进行小胶质细胞清除，Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}小鼠依然表现出迟钝的再生反应。这些结果表明，CDKN1A的持续高表达足以损害成年小胶质细胞的在体增殖能力。

Mouse line-dependent abnormal responses of postnatal microglia in Cx3cr1CreERT2 mice

研究人员将关注点转向发育早期。他们在 postnatal day (P)1 和 P3 对新生鼠进行TAM处理，并在P7和P14进行分析。Bulk RNA-seq结果显示，TAM处理的Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}小鼠小胶质细胞出现了剧烈的转录组变化，共有172个基因上调（包括Axl、Cdkn1a以及I型干扰素应答基因如Ifitm3、Mx1），96个基因下调（包括小胶质细胞核心基因如P2ry12、Sall1、Hexb）。而Cx3cr1^{CreERT2(Jung)}小鼠仅表现出微小的差异。Cdkn1a的表达与干扰素应答基因呈正相关，与小胶质细胞核心基因呈负相关。组织学分析证实，TAM处理的Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}小鼠在P7时小胶质细胞密度显著降低，虽在P14有所恢复但仍低于对照，并且细胞形态发生改变。流式细胞术也检测到细胞增大和CD45表达升高的现象。尤为显著的是，Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}小鼠小胶质细胞中Ki67⁺增殖细胞的比例异常升高。进一步的细胞周期分析揭示了表型背后的机制：尽管进入细胞周期的细胞增多（Ki67⁺），但这些细胞更多地停滞在G2/M期（pH3⁺），而S期（EdU⁺）细胞比例减少，表明存在CDKN1A介导的细胞周期阻滞。最终，这导致了凋亡细胞（TUNEL⁺）的增加。这些异常现象在另一个小胶质细胞特异性工具鼠品系Hexb^CreERT2中并未观察到，强调了这是Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}品系特有的问题。

CDKN1A mediates abnormal cellular responses of postnatal microglia in Cx3cr1CreERT2(Litt) mice

为直接验证CDKN1A是否介导了上述异常表型，研究人员对TAM处理的Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}新生鼠使用了CDKN1A抑制剂UC2288。结果显示，UC2288处理有效减轻了TAM引起的小胶质细胞密度下降。更重要的是，Bulk RNA-seq和PCA分析表明，UC2288处理几乎完全逆转了TAM诱导的剧烈转录组变化，使基因表达谱恢复到接近正常状态，例如下调了Mx1，上调了Tmem119。qPCR也证实干扰素应答基因Mx1的表达被显著抑制。而在野生型小鼠中，UC2288处理本身并不引起小胶质细胞基因表达的显著变化。这些挽救实验证明，CDKN1A的功能性激活是导致Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}小鼠小胶质细胞出现异常反应的关键分子。

本研究通过多层次、多维度的系统比较，揭示了一个重要现象：广泛使用的Cx3cr1^CreERT2工具小鼠存在品系依赖性的差异。Specifically, Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}品系在TAM诱导后，其小胶质细胞及其他Cx3cr1⁺髓系细胞会出现CDKN1A/p21的长期、持续性高表达，这一现象由表观遗传机制（如H3K27ac增加和染色质开放）驱动，而在Cx3cr1^{CreERT2(Jung)}品系中则不存在。这种CDKN1A的异常表达具有明确的功能性后果：在成年期，它损害了小胶质细胞在清除后再增殖模型中的恢复能力；在发育早期，它引发了剧烈的干扰素样反应和转录组重编程，导致细胞周期阻滞、增殖异常和凋亡增加，从而显著改变小胶质细胞的密度和状态。

该研究的发现具有多重重要意义。首先，它直接解释了以往使用不同Cx3cr1^CreERT2品系可能产生矛盾结果的原因，为未来研究的实验设计提供了关键参考，强烈建议研究者根据具体科学问题谨慎选择品系，并在发表成果时明确标注所用品系的具体来源（Jung或Litt）。其次，研究证实通过药理抑制CDKN1A活性可以挽救Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}品系的异常表型，这为那些已使用该品系生成的数据提供了一个潜在的补救或解释途径。更深远的意义在于，Cx3cr1^{CreERT2(Litt)}小鼠意外地成为了一个能够特异性、可诱导地在髓系细胞中长期表达CDKN1A的独特工具鼠，为研究CDKN1A在免疫细胞（特别是小胶质细胞）衰老、应激反应和功能调控中的作用提供了新的模型。最后，该研究也警示科学界，遗传工具鼠本身的遗传背景和构建策略可能引入不可预见的实验变量，对工具鼠进行彻底的标准化和表征是确保科学研究可靠性的基石。