微生物代谢物2-甲基异柠檬酸通过调节核苷酸代谢和线粒体功能增强5-氟尿嘧啶的抗癌疗效

本研究发现肠道微生物代谢物2-甲基异柠檬酸（2-MiCit）能显著增强5-氟尿嘧啶（5-FU）的抗癌效果。通过多组学分析和体内外实验验证，揭示了2-MiCit通过抑制异柠檬酸脱氢酶（IDH）活性、干扰三羧酸循环（TCA cycle）和核苷酸代谢，诱导DNA损伤和p53通路激活，从而协同增强5-FU的细胞毒性作用。该研究为微生物代谢物调控化疗疗效提供了新机制，为结直肠癌（CRC）的联合治疗策略开发提供了重要依据。

　　

营养调控5-FU疗效的细菌依赖性机制

研究通过建立高通量宿主-微生物-药物-营养四维筛选体系，发现5-FU对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的生长抑制作用受到细菌菌株种类和培养基营养成分的双重调控。在91种细菌菌株（涵盖放线菌门、厚壁菌门和变形菌门）的测试中，不同菌株对5-FU的响应存在显著差异。特别值得注意的是，细菌的嘧啶核苷酸代谢通路（包括从头合成途径和补救合成途径）在调节5-FU疗效中发挥关键作用。当使用缺乏嘧啶从头合成关键酶基因pyrE的细菌突变株时，葡萄糖等糖类物质对5-FU的保护作用完全消失，而缺乏补救合成途径相关基因（udp、udk、upp）的三重突变株则能增强糖类的保护效应。

细菌代谢物调控5-FU疗效

研究团队通过表型微阵列技术分析了378种代谢物对5-FU疗效的影响，发现细菌的磷酸转移酶系统（PTS）和环腺苷酸受体蛋白（CRP）调控通路在其中扮演核心角色。缺失crp基因的细菌在含动物蛋白的培养基中显著降低5-FU疗效，而在葡萄糖存在时则增强药物效果。进一步的三维宿主-微生物-药物筛选显示，中央碳代谢和核苷酸代谢相关基因的缺失显著影响5-FU的疗效。特别是细菌通过糖酵解和三羧酸循环（TCA cycle）代谢糖类产生嘧啶核苷酸代谢物，这些代谢物能够调控药物对宿主的作用效果。

2-MiCit的生产及其抗癌特性

研究通过微生物群落代谢模型预测发现，结直肠癌相关的微生物组具有更高的2-甲基异柠檬酸（2-MiCit）生产能力。实验验证表明，来自变形菌门等癌症相关微生物确实能够产生毫摩尔级别的2-MiCit，且其分泌水平在预测的高产菌株中显著更高。代谢模型分析显示，大肠杆菌（E. coli）能够利用120种营养物质作为底物生产2-MiCit，其中糖类、糖苷和羧酸是主要底物类型。在生理浓度的丙酸盐条件下，2-MiCit的产量在氧气依赖模式下可增加一倍。

功能实验表明，2-MiCit对20种肿瘤细胞系（涵盖血液、骨骼、乳腺、盲肠和结肠来源）表现出广泛的抗增殖作用，其中16种细胞系的生长受到显著抑制。在三维HCT116结直肠癌球体模型中，2-MiCit处理显著抑制了球体生长。在果蝇肠道肿瘤模型中，2-MiCit处理减少了肿瘤播散病灶数量并延长了生存期。

2-MiCit损害线粒体代谢并诱导DNA损伤

机制研究发现，2-MiCit是线粒体异柠檬酸脱氢酶（IDH）的有效抑制剂，能够剂量依赖性地抑制线粒体呼吸功能。代谢组学分析显示，2-MiCit处理导致IDH上游代谢物（乌头酸和柠檬酸）积累，而下游代谢物（2-酮戊二酸和琥珀酸）减少。RNA测序分析表明，2-MiCit在7种结直肠癌细胞系中共同调控细胞周期、DNA损伤修复、嘧啶代谢和p53信号通路等相关基因的表达。

2-MiCit处理增加了细胞凋亡和坏死比例，减少了S期细胞百分比，提高了DNA损伤标志物γH2AX的强度，增加了53BP1核体数量，并上调了损伤特异性DNA结合蛋白2（DDB2）的表达。在p53缺陷型HCT116细胞中，2-MiCit的抗增殖效应更为显著，但对线粒体呼吸的抑制作用较弱，表明p53在介导2-MiCit的代谢效应中具有保护性作用。

2-MiCit通过调节核苷酸代谢增强化疗效果

高通量药物筛选显示，2-MiCit与核苷和核苷酸类抗代谢药物（包括5-FU）具有显著协同作用。2-MiCit与5-FU的联合使用表现出强烈的协同抗增殖效应（ZIP评分=4.83）。蛋白质组学分析发现，2-MiCit处理逆转了5-FU引起的嘧啶代谢和TP53信号通路上调，并下调了大多数嘧啶核苷酸和脱氧核苷酸代谢相关酶的表达。

在代谢水平上，5-FU增加了除胸苷三磷酸（TTP）外的大多数核苷酸水平，而2-MiCit则降低了核苷酸丰度，并拮抗了5-FU引起的核苷酸增加。2-MiCit还减少了5-FU活化代谢物（5-FUMP和5-FUrd）的生成，这与氟嘧啶代谢或摄取相关酶的下调一致。在三维球体模型中，2-MiCit同样拮抗了5-FU对嘧啶通路关键酶的上调作用，并与5-FU协同抑制球体增殖。

合理的化学设计增强2-MiCit效力

研究团队通过有机合成获得了纯化的(2R,3S)-2-MiCit对映体，发现其抑制IDH和抗增殖的效力优于商业外消旋混合物。通过对2-MiCit化学结构的理性修饰，创建的三甲基酯衍生物在二维和三维细胞模型中表现出显著增强的抗增殖活性，且不增加体外IDH抑制活性，表明甲基化修饰和提高的渗透性是增强其抗增殖特性的关键。这种改良的三甲基-2-MiCit化合物为未来的癌症治疗研究提供了有前景的候选分子。