细菌基因组中转座子插入位点的直接Sanger测序定位技术开发与应用

本刊推荐：本研究创新性地利用直接Sanger测序技术（无需PCR扩增）成功定位革兰氏阴性菌（Salmonella enterica）和革兰氏阳性菌（Staphylococcus aureus）基因组中的转座子插入位点。通过优化DNA剪切模式（~2 kb）、测序反应体系（75-100循环）和毛细管电泳参数，实现了单拷贝基因的高精度测序（~500-800 nt读长），为细菌基因功能研究提供了经济（约10美元/反应）、高效（8小时完成）的技术方案。

　　

Highlight

Introduction:

微生物生物医学研究中，通过转座子（Transposon）随机或靶向插入细菌DNA是常见的遗传操作手段。目前转座子插入位点的鉴定主要依赖下一代测序（NGS）或基于PCR产物的Sanger测序（如巢式PCR、反向PCR、高效TAIL-PCR等）。这些方法虽有效，但存在操作繁琐、成本较高或需要特定引物设计等局限性。

Preliminary experiments:

为模拟细菌基因组中单转座子插入场景，初步实验使用pGEM 3Zf(+)质粒DNA（3197 bp）与灵长类DNA（大猩猩Gorilla gorilla）混合，设置三种比例（约1:200、1:1250和1:2500）模拟单拷贝目标序列在基因组背景中的情况。

Data Analysis:

测序数据通过ABI Sequencing Analysis Software 6.2进行碱基识别，并通过SequenceScanner 2.0进一步分析。使用NCBI BLAST将Salmonella序列与GenBank ID AM933172.1比对，S. aureus序列与USA300染色体完整序列比对。利用Notepad++识别转座子与细菌DNA间的断裂点。

Parameter optimization for Sanger-Sequencing of bacterial gDNA:

经剪切和磁珠纯化的DNA片段分布范围为~400-10,000 bp，主峰约2000 bp（Agilent Bioanalyzer检测）。在1:2500质粒-灵长类DNA比例下，标准25循环+0.5 μl BigDye的反应信号较弱；将循环数增至50+1.5 μl BigDye后信号显著增强。最终优化条件为：75-100 PCR循环、2.5 μl BigDye v3.1、2 μl测序聚合酶（8 U/μl）和1.5 μl引物（3.2 μM），使用乙醇-EDTA沉淀法纯化产物。

Discussion:

本Sanger测序方法成功映射了Salmonella enterica（~4.9 Mb）和Staphylococcus aureus（~2.81 Mb）基因组中随机插入的转poson位点。基于单转座子插入假设，每个引物靶点在纯细菌培养物基因组DNA中仅存在一个结合位点，通过直接测序即可获得转座子-基因组连接处的序列信息。

Conclusion:

该方法无需PCR扩增即可直接对细菌基因组DNA进行Sanger测序，显著简化了转座子定位流程。优化的实验方案（DNA提取后步骤）可在8小时内完成，每个反应成本约10美元，且适用于小型基因组（<5 Mb）中天然单拷贝基因的测序研究。