体外合成超螺旋环状DNA分子的创新方法及其在基因治疗中的应用潜力

本研究针对传统质粒DNA在细菌中生产存在的甲基化修饰、细菌序列污染等问题，开发了两种新型体外生化方法（PCR法和RCA法），通过Cre/loxP重组系统高效合成高纯度超螺旋（Sc）环状DNA。研究成果显示，体外合成的2 kb EGFP-FL在哺乳动物细胞中的转染效率显著高于大肠杆菌来源的DNA，为基因治疗和疫苗开发提供了无细菌污染的新型DNA载体平台。

　　

在分子生物学和基因治疗领域，超螺旋（Sc）环状DNA（如质粒）是至关重要的工具，但传统的大肠杆菌生产体系存在固有缺陷：细菌甲基化修饰（如Dam/Dcm位点的6mA和5mC）可能引发人体免疫反应，抗生素抗性基因存在水平转移风险，且难以彻底去除内毒素等污染物。这些问题严重限制了质粒DNA在临床中的应用，尤其是随着DNA疫苗（如印度获批的ZyCoV-D新冠疫苗）和基因治疗（占2023年临床试验的12.6%）的快速发展，开发无细菌污染的DNA合成技术成为迫切需求。

为解决这一技术瓶颈，佛罗里达国际大学Fenfei Leng团队在《Nucleic Acids Research》发表研究，创新性地建立了两种不依赖细菌的体外合成方法。关键技术包括：1）通过PCR或滚环扩增（RCA）生成含同向loxP位点的线性DNA；2）利用Cre重组酶环化DNA；3）T5核酸外切酶消化残留线性DNA；4）大肠杆菌DNA旋转酶或痘苗病毒拓扑异构酶I（vTop1）引入超螺旋。

研究结果部分：

PCR法合成Sc环状DNA

以pLoxFL为模板，通过含loxP序列的引物扩增2.9 kb线性DNA，经Cre重组和T5处理获得2.8 kb松弛态（Rx）环状DNA，再通过DNA旋转酶成功转化为Sc形态。值得注意的是，427 bp的小环状DNA（minicircle 2）因尺寸限制无法被旋转酶有效超螺旋，但痘苗病毒拓扑异构酶I在溴化乙锭（EB）存在时可高效完成超螺旋化。

RCA法大规模生产

使用Φ29 DNA聚合酶扩增含loxP位点的模板DNA，经BamHI消化后获得2.9 kb线性片段，Cre重组效率达74%。该方法可从1.5 μg模板量产1 mg级Sc DNA，如2 kb的EGFP-FL（含CMV启动子-EGFP-SV40 polyA元件）。

转染效率突破

体外合成的Sc EGFP-FL在HeLa和C2C12细胞中的转染效率显著高于大肠杆菌来源的同类DNA。实验显示，其荧光强度提高约3倍（图5D），这归因于无细菌甲基化修饰和更低的基因组DNA/内毒素污染（实时PCR检测显示细菌DNA残留量减少90%）。

微型环状DNA的物理特性

成功合成196 bp的minicircle 4，虽主要形成二聚体，但为研究DNA弯曲和超螺旋诱导的构象变化提供了理想模型。

研究结论指出，这两种方法可合成196 bp至数kb的Sc DNA，产量从微克到毫克级，具有三大革命性优势：1）完全避免细菌甲基化和序列污染；2）可定制化去除抗生素抗性基因等非必需元件；3）通过Φ29聚合酶的高保真性实现临床级DNA生产。该技术不仅为基因治疗提供了更安全的载体选择，其构建的微型环状DNA还为单分子生物物理学研究开辟了新途径。

（注：所有数据均源自原文，专业术语如RCA=Rolling Circle Amplification，vTop1=variola virus topoisomerase I，Sc=supercoiled等均在首次出现时标注）