利用CatWalk系统对α-突触核蛋白转基因L62小鼠步态表型的系统性性别与年龄差异分析

本研究针对帕金森病（PD）中α-突触核蛋白（α-synuclein）聚集导致的运动障碍，采用CatWalk自动步态分析系统对表达人全长α-synuclein的L62转基因小鼠进行系统性步态评估。研究发现L62小鼠存在运动时间减少、后肢支撑基座（BOS）缩小以及时空肢体协调缺陷，且老年雄性小鼠表型更为显著。该研究为α-synuclein相关神经退行性疾病提供了敏感且客观的运动表型分析范式，对PD机制研究和临床前药效评价具有重要价值。

　　

在神经退行性疾病研究领域，帕金森病（Parkinson’s disease, PD）因其明确的运动障碍特征而成为重点研究对象。患者常表现出步态迟缓、步幅缩短、平衡能力下降等典型症状，其病理核心是中脑多巴胺能神经元的退行性变和路易体（Lewy bodies）的形成，而后者主要由错误折叠的α-突触核蛋白（α-synuclein）聚集构成。尽管PD的临床诊断依赖于这些运动症状，但确诊仍需死后脑组织病理检查发现α-synuclein聚集。因此，开发能够模拟人类PD病理特征且能客观量化运动障碍的动物模型，对于理解疾病机制和筛选有效治疗方案至关重要。

在众多PD动物模型中，L62转基因小鼠因其表达人全长α-synuclein并与信号肽融合，在神经元特异性Thy-1启动子驱动下，表现出广泛的中枢神经系统α-synuclein沉积，包括大脑皮层、海马、基底前脑、纹状体、黑质和丘脑等区域。这一病理分布特点使其成为模拟帕金森病和路易体痴呆（dementia with Lewy bodies, DLB）等突触核蛋白病的理想临床前模型。尽管此前研究已通过旷场实验（open field）和平衡木测试（beam test）观察到L62小鼠存在运动协调缺陷，但这些方法多依赖观察者主观判断且对早期、细微的运动变化不够敏感。

近年来，自动化的步态分析系统CatWalk被逐渐应用于啮齿类动物运动功能的精细评估。该系统通过动物在 illuminated glass walkway（ illuminated玻璃走道）上的自发行走，记录其爪印图像与运动时序，可量化包括运动学参数、协调性、空间和时间维度在内的多项步态指标，具有客观、可重复、高通量等优势。然而，针对α-synuclein转基因模型的系统性CatWalk研究，尤其是年龄与性别因素的交互影响，仍较为缺乏。

为此，来自英国阿伯丁大学（University of Aberdeen）的研究团队开展了一项系统研究，旨在利用CatWalk系统全面评估L62转基因小鼠在不同年龄（6月龄与12月龄）和性别条件下的步态表现，并探究其与脑内α-synuclein沉积的相关性。该研究论文发表在《Behavioural Brain Research》上。

本研究主要采用了以下几种关键技术方法：使用94只L62转基因小鼠和野生型（WT）对照，按基因型、年龄（6月/12月）、性别（雄/雌）分为8组；通过CatWalk XT 9系统采集步态数据，分析包括运动速度、运行时间、支撑基座（BOS）、步幅长度、步序规律性、空间印迹参数（如印迹长度、宽度、面积）和时间参数（如站立相、摆动相、步态周期等）；对运动皮层组织进行免疫组化染色（使用单克隆抗体mAb204），定量α-synuclein阳性神经元密度；采用三因素方差分析（ANOVA）检验基因型、年龄、性别的主效应和交互作用，并通过Pearson相关性分析探索步态参数与α-synuclein病理之间的关联。

研究结果如下：

3.1. 一般参数

L62小鼠体重显著高于WT，雄性重于雌性，且12月龄重于6月龄。所有步态参数均按体重标准化以消除体重差异的干扰。

3.2. 运动与步态分析

CatWalk系统成功捕获了四类步态参数：运动学特征、协调性、空间肢体协调和时间肢体协调。

3.3. 运动学特征

与WT相比，L62小鼠总体运行时间更短。雄性小鼠运行时间和平均速度均低于雌性，12月龄小鼠运行时间短于6月龄，且运行速度变异更大。

3.4. 协调性特征

雌性小鼠的前后肢支撑基座（BOS）和步幅长度均大于雄性。L62转基因小鼠后肢BOS显著小于WT。在步序模式使用上，雄性小鼠存在偏好差异，而雌性无此现象。

3.5. 空间肢体协调

在空间参数（包括印迹长度、宽度、面积和最大接触面积）上，雌雄之间存在显著差异。基因型相关差异在6月龄雄性和12月龄雌性中最为明显，表明L62小鼠在12月龄时出现显著的空间协调缺陷。

3.6. 时间肢体协调

时间参数（如站立、摆动、步态周期、接触强度相关参数）在雌雄和不同年龄中均有差异。L62雌鼠在6月龄时已表现出时间协调缺陷，并持续至12月龄；而雄鼠的缺陷直到12月龄才显现。相关性热图分析进一步显示，L62小鼠在6月龄时雌性出现更多负相关（红色），至12月龄时雄性和雌性均出现更多正相关（蓝色），表明年龄增长加剧了时间协调模式的异常。

3.7. α-synuclein与步态的关联

免疫组化显示L62小鼠运动皮层存在明显的α-synuclein阳性神经元沉积，而WT无此现象。在6月龄L62雄鼠中，α-synuclein沉积与多数步态参数呈负相关，而在同龄雌鼠中则呈正相关。至12月龄时，这种相关性基本消失，仅后肢BOS（雄鼠）和规律性指数（雌鼠）与α-synuclein仍存在显著相关。

综合以上结果，本研究得出以下结论：L62α-synuclein转基因小鼠表现出广泛的步态异常，包括运动时间减少、后肢支撑基座缩小、以及时空协调功能缺陷。这些异常具有明显的年龄与性别特异性：运动学与协调相关缺陷在L62小鼠中较早出现（6月龄），而空间和时间协调障碍则在12月龄时更加显著；其中，时间协调缺陷在雌性中出现更早，而空间缺陷在雄性中更早显现。脑内α-synuclein病理与步态参数的相关性在青年鼠中呈现性别依赖性相反趋势，提示不同性别的疾病机制可能存在差异。

讨论部分强调，本研究首次在L62模型上采用CatWalk系统进行了系统性、多维度步态分析，并揭示了α-synuclein沉积与运动表型之间的年龄-性别交互作用。这一方面证实了L62小鼠作为PD/DLB模型的有效性，另一方面也凸显了CatWalk在检测细微、早期运动障碍方面的灵敏度。与既往研究相比，本研究不仅证实了α-synuclein转基因动物中步幅缩短、支撑基座变化等典型异常，还进一步揭示了时空协调模式的改变及其与病理的相关性，这些发现与临床PD患者的步态不对称性和协调障碍高度吻合。

此外，性别差异的发现尤为值得关注。雄性在PD发病中通常风险更高，而女性则预后较差，本研究在动物层面为这一临床现象提供了机制探索的起点——可能与雌激素水平、α-synuclein聚集形态或神经环路差异性受损有关。未来研究可进一步结合行为学、病理生化与分子影像技术，在L62模型上深化PD性别差异机制的研究。

总之，该研究不仅为α-synuclein相关神经退行性疾病的临床前研究提供了详实的表型数据，也建立了利用自动化步态分析系统进行客观、精细化行为表型鉴定的标准流程，对PD疾病机制研究、生物标志物发掘及治疗策略开发均具有重要意义。