综述：基于片段的药物发现：图解综述

本综述系统图解了基于片段的药物发现（FBDD）这一成熟强大的新药研发策略。文章详述了其从遵循“三规则”（Rule of 3）的片段库设计、借助高灵敏度生物物理方法（如NMR, X-ray, SPR）进行筛选，到通过结构指导的片段生长、连接或合并等策略将弱结合片段（KD为μM-mM级）优化为高效先导化合物的全流程。FBDD凭借高配体效率（LE）、高命中率及攻克“不可成药”靶点（如KRAS G12C）的成功案例，已成为现代药物研发的基石。

　　

1. 引言

基于片段的药物发现（Fragment-Based Drug Discovery, FBDD）已成为现代药物开发的基石，为识别和优化具有卓越化学多样性及效率的新型先导化合物提供了强大工具。尽管存在细微差别，但在此图解综述中，该术语将与基于片段的先导化合物发现（Fragment-Based Lead Discovery, FBLD）互换使用。在FBDD中，通常遵循“三规则”（分子量MW ≤ 300、脂水分配系数logP ≤ 3、氢键供体/受体数 ≤ 3）的极小分子（“片段”）被筛选以发现弱结合作用，随后将有前景的命中片段通过生长、连接或合并策略生成强效先导化合物。片段的简单性赋予了其高配体效率（Ligand Efficiency, LE），并与传统高通量筛选（High-Throughput Screening, HTS）的命中物相比，提供了更大的优化空间。FBDD的价值在20世纪90年代末通过“SAR by NMR”方法得到验证，到21世纪初，开创性的例子已确立FBDD作为HTS强大且互补的替代方案。这一成功很大程度上归功于其显著更高的命中率，通常可达5%–20%，而HTS的命中率通常低于1%。早期的综述记录了其迅速崛起，片段衍生的先导化合物进入试验并推进至临床阶段。

片段能高效地探索化学空间：一个仅包含500至3000个化合物的库即可覆盖广泛的化学型多样性。其小尺寸使它们能够占据隐蔽口袋和其他具有挑战性的位点，如蛋白-蛋白界面和变构位点。尽管浅结合口袋对任何小分子仍然是重大挑战，但源自片段的共价配体有潜力为这些位点实现更好的效力。虽然它们的结合亲和力通常较弱（K_D为高μM–mM级），但这些命中物具有高配体效率，并可作为易处理的起点。重要的是，片段命中物通常代表新颖的化学型；精心优化可产生具有改善选择性的类药先导化合物。FBDD的成功反映在不断扩大的研发管线中：到2016年，已有超过30个源自片段的临床候选药物和两种药物出现。如今，这一数字已超过50个临床候选药物和至少7种获批药物，涵盖肿瘤学和传染病领域。

可靠地检测极弱结合物仍然是主要的技术挑战。片段筛选需要具有低假阳性率的高灵敏度方法。一旦识别出片段命中物，就必须从低起始亲和力开始有效优化，这依赖于稳健的药物化学和结构见解。严格管理的库，由可溶性、无反应性且无泛筛选干扰化合物（Pan-Assay Interference Compounds, PAINS）的片段组成，至关重要。库设计、筛选技术和优化策略的持续发展推动了不断改进。下文将详述FBDD的基本步骤：从库设计和筛选到命中验证、优化以及新兴进展。

2. 片段库设计

一个精心设计的片段库是FBDD成功的基础。早期的库遵循“三规则”，确保片段小而相对亲水。现代库优先考虑3D形状多样性和柔性，这一趋势被称为“逃离扁平界”，旨在改善物理化学性质、减少泛结合性并获取新的结合模式。然而，最近的分析表明这种趋势应加以平衡，因为更高的三维特性（Fsp³）与2009年后批准药物的临床成功之间的关联并未持续。这种“回归扁平界”凸显了更扁平、富含sp²的片段仍然是极具价值且成功的起点，特别是因为富含3D的库对于挑战性靶点可能产生较低的命中率。因此，多样性是关键：有效的库采样广泛的化学型，包括富含sp²和sp³的支架框架，以最大化发现不同靶点命中物的可能性。随着时间的推移，包含手性和特权片段（识别为结合特定口袋的 motif）的情况有所增长。

片段可以针对特定靶点类别进行定制；例如，用于激酶或G蛋白偶联受体（GPCRs）的共价半胱氨酸结合片段。最近，基于共价片段的发现已成为日益流行和成功的策略，部分是由靶向共价抑制剂的临床成功所驱动。这种方法通常涉及筛选已经装备有反应性“弹头”（通常是亲电基团）的片段库，或在优化过程中将反应部分附加到非共价片段命中物上。虽然半胱氨酸是最常靶向的氨基酸，但近期的努力已扩展了工具包，包括可以与其他残基（如赖氨酸、酪氨酸和丝氨酸）反应的弹头，拓宽了可靶向的蛋白质范围。这些策略已被证明非常有效，甚至在细胞筛选中，用于发现针对挑战性靶点（包括酶和蛋白-蛋白相互作用）的强效和选择性抑制剂。共价方法的一个关键优势是它极大地促进了计算建模；了解蛋白质上的附着点为预测片段的结合姿态和指导后续优化提供了强大的锚点。

片段必须是“可筛选的”：高度可溶（以实现高浓度检测）、化学稳定且易处理（以允许快速跟进进展），并且没有聚集或非特异性结合。严格的质量控制去除了有问题的化合物，如PAINS。Keser?等人调查了制药公司的片段库，并强调随着新设计原则的出现需要持续改进。排除过于亲脂的片段很重要，因为生长片段通常会增加疏水性；从极性片段开始有助于保持类药性质。配体效率（LE，关注化合物效力与其分子大小的关系）和依赖于配体效率的亲脂性（LEAT，在效率计算中加入了亲脂性）等指标指导优先选择具有最佳效力和物理化学平衡的命中物。当代库通常混合商业和定制片段。对动态或系链片段（例如，可逆共价片段、片段合并池）的兴趣正在上升，以进一步扩展可访问的化学空间。最终，一个高质量的片段库是紧凑但化学多样的，由“干净”的化合物填充，以最大化新型结合物的发现。

除了传统的片段集合，DNA编码库（DNA-Encoded Libraries, DELs）代表了用于筛选的强大且高度多样化的化学物质来源。DEL是一种高通量筛选技术，采用独特的DNA标签来编码和识别大量的小分子集合，使得能够快速发现与生物靶点结合的物质。简而言之，DEL将每个小分子与一个独特的DNA条形码连接，允许从涉及数百万至数十亿化合物的筛选中高效选择、扩增和测序命中物。然而，分析DEL数据可能具有挑战性，特别是从通常产生的高命中率中识别弱结合物。

最后，片段库的虚拟筛选现在与实验活动一起常规进行，通常使用分子对接和分子动力学模拟来分别识别和优先排序命中物。然而，这些预测的可靠性可能受到用于近似复杂结合相互作用的底层力场和评分函数不准确性的阻碍。为了克服这些挑战，机器学习（Machine Learning, ML）模型正日益被整合以增强片段评分并预测有前景的类似物。虽然这些先进的计算方法正在显著提高筛选效率，但它们的前瞻性应用仍在发展中，许多当前模型尚未从基准测试练习过渡到在真实世界药物发现活动中持续成功。

3. 片段筛选策略

由于片段结合亲和力通常较弱，需要专门的生物物理筛选方法。

3.1. NMR光谱学

NMR光谱学是一种高灵敏度的方法，用于检测弱（mM K_D）片段结合。配体观察技术（例如，通过STD-NMR、WaterLOGSY、¹⁹F NMR）尤其有利，因为它们不需要修饰蛋白质，并且可以在较低配体浓度下检测低占据结合事件，减少浓度相关假象。例如，¹⁹F NMR提供具有很少背景的独特信号，允许混合筛选工作流程。蛋白质观察方法（例如，HSQC）提供更直接、原子水平的信息关于结合位点和配体方向，但通常需要昂贵的同位素标记蛋白质（例如，用¹⁵N和/或¹³C）和专门的硬件设施。NMR光谱学，虽然是原始“SAR by NMR”方法的核心，但通常缺乏像X射线晶体学等技术提供的详细3D结构信息。

3.2. X射线晶体学

X射线晶体学是FBDD的金标准。将靶蛋白晶体与片段进行浸泡或共结晶，随后测定其结构，可以直接识别结合物及其姿态。X射线片段筛选揭示了结合热点和隐蔽位点。例如，片段结合的丙型肝炎病毒非结构蛋白3蛋白酶/解旋酶结构揭示了新的结构域间口袋。尽管通量限制在每天几百个数据集，但X射线筛选通常给出明确的结果并直接指导化学。为了解决这一限制，高通量晶体学片段筛选已在专门的同步辐射设施（例如，英国的XChem）开创。这些平台使该技术更易获取，并能够快速筛选数千个片段，为众多项目提供丰富的结构数据。实现这一点的关键创新是整合了先进的计算工具，如PanDDA算法，该算法可靠地检测弱的、低占据的片段结合，这些结合通常被常规分析遗漏。高通量数据收集和灵敏分析的结合对于主要倡议的成功至关重要，包括在“COVID Moonshot”项目中快速开发SARS-CoV-2主要蛋白酶抑制剂。

3.3. 冷冻电子显微镜（Cryo-EM）

Cryo-EM是一种用于片段筛选的新兴技术，尚未达到常规应用的成熟度。Cryo-EM可以确定蛋白质-片段复合物的结构，这对于抵抗结晶的大、动态或膜结合靶点特别有用。虽然最初作为概念验证展示，但最近的工作通过实现对挑战性靶点（如膜蛋白）的高通量结构确定，验证了其用于常规片段筛选。然而，重大挑战仍然存在。与X射线晶体学中晶格限制配体构象不同，Cryo-EM中颗粒的动态性质为片段筛选带来了相当大的困难。该过程需要高片段占据率，并且在颗粒间一致的结合姿态，以避免在图像处理和3D重建过程中平均掉信号。这些严格的要求，加上图像筛选和聚类的复杂性，意味着Cryo-EM尚未成为初级片段筛选的常规或金标准方法。此外，一种相关技术，微晶电子衍射（Microcrystal Electron Diffraction, MicroED），也已通过将电子衍射应用于纳米晶体来成功识别片段命中物，从而扩展了用于结构表征弱结合物的工具包。为了使Cryo-EM在FBDD中得到更广泛的应用，一个有前景的未来方向是将计算方法与较低分辨率图谱（3.5–4.5 ?）整合，其中分子对接和ML可以帮助在实验密度模糊时准确放置片段，以指导药物设计。

3.4. 质谱（MS）

基于MS的筛选包含多种技术。变性方法如亲和选择-MS（Affinity Selection–MS, AS-MS）和氢-氘交换MS（Hydrogen–Deuterium Exchange MS, HDX–MS）分别用于识别命中物或映射结合位点。对FBDD特别强大的技术是天然质谱（Native MS, nMS），它直接检测完整的、非共价的片段-蛋白质复合物。这允许快速确定结合化学计量，这有助于区分特异性和非特异性结合，并减少假阳性。此外，nMS可用于计算结合亲和力（K_D），并且可能优先检测焓驱动的相互作用，这通常被认为是优化的更高质量起点。虽然所有MS方法都提供高灵敏度且蛋白质消耗最少，但nMS提供了在近天然状态下直接观察特定结合事件的独特优势。最近，MS-蛋白质组学方法也已成功应用于跨整个蛋白质组的共价片段筛选，允许广泛分析片段反应性和选择性。

3.5. 功能性/生化检测

功能性/生化检测是FBDD活动中基础的筛选方法，在过去十年中持续代表了命中发现策略的重要部分。虽然大多数片段的弱亲和力是一个挑战，但当这些检测足够灵敏以检测命中物时，通常在高配体浓度下，它们可以成功应用。活性基蛋白质分析（Activity-Based Protein Profiling, ABPP）是一个强大的例子，这是一种功能性化学蛋白质组学技术，用于监测整个酶家族的活性，它已成功适用于共价FBDD。此外，该技术（即ABPP）是能够以高灵敏度快速评估片段和小分子库的高通量筛选平台的基础。尽管其他生物物理方法也很普遍，但生化检测的持续使用突显了它们在识别初始片段命中物方面的持久重要性。

3.6. 计算（虚拟）筛选

在计算机中对片段与靶蛋白进行对接有助于有效识别潜在结合物。目前，计算（虚拟）筛选已从筛选数百万库存化合物发展到导航超过400亿个分子的庞大“按需定制”化学空间。对此的一种高效策略是虚拟片段筛选，其中对接大型片段库（例如，1400万个化合物）以惊人的准确性和比 comparable 实验筛选（例如，HTS）更高的命中率识别初始命中物。为了管理这些巨大的库，ML现在正被整合到流程中。在初始对接结果上训练的ML模型可以优先考虑化学空间区域，将需要显式对接的化合物数量减少多达100倍。大规模对接和ML之间的协同作用已通过将初始片段命中物快速、结构指导地细化为亚微摩尔先导化合物，成功发现了针对挑战性靶点（包括病毒酶和GPCRs）的强效抑制剂。

3.7. 其他技术：表面等离子共振（SPR）、差示扫描荧光（DSF）和等温滴定量热法（ITC）

SPR是一种广泛使用的、高通量的初级片段筛选技术。它是一种无标记方法，通过测量固定有靶蛋白的传感器芯片上的折射率变化来检测实时结合。这允许快速排序片段并提供有价值的动力学数据（k_on/k_off），尽管它可能容易受到非特异性结合假象的影响。另外两种常见方法，通常用于命中验证而非初级筛选，是DSF和ITC。DSF（也称为热位移 assay, TSA）是一种快速、高通量的方法，测量配体结合时蛋白质稳定性的变化。然而，已知它具有高假阳性和假阴性率，使其成为不太可靠的初级检测。ITC提供结合的完整热力学谱（ΔG, ΔH, 和 ΔS），但其低通量和非常高的蛋白质消耗使其最适合在发现过程后期验证和表征中等至强的相互作用。

3.8. 正交方法

使用正交方法（结合多种互补筛选）是一种标准策略，可以交叉验证命中物、增加置信度并减少假阳性。例如，通过NMR识别并通过X射线或SPR确认的片段更可能是真正的结合物。正交筛选还有助于通过结合位点对片段进行分类（例如，通过竞争SPR或NMR表位作图）。对该领域的仔细审视揭示了一个清晰的、协同的趋势：先进的生物物理方法（用于膜蛋白和大复合物的Cryo-EM，用于完整蛋白质-配体复合物的Native MS，用于构象动力学的HDX-MS）正在扩展可以物理筛选的靶点范围。这种协同作用通过新兴的人工智能（AI）模型（如Boltz2）得到进一步增强，该模型可以以接近计算昂贵的自由能微扰（Free-Energy Perturbation, FEP）方法的准确性预测结合亲和力，从而允许快速计算机优先排序片段以进行实验验证。

3.9. DNA编码动态库（DEDLs）

DEDLs的最新出现通过将DEL与动态组合化学相结合，显著推进了FBDD，克服了传统库大小的限制，并促进了罕见但高亲和力片段结合物的检测。

3.10. 合成可及性及其他考虑因素

在命中物跟进期间考虑合成可及性至关重要：一些片段命中物，尤其是来自高通量X射线筛选的，由于缺乏可获取的类似物而被降低优先级。早期规划合成路线可以影响哪些命中物被推进。应对这一挑战的一种创新方法是使用高通量晶体学直接评估粗反应混合物，这种方法称为结合位点活性纯化（Binding-site Purification of Actives, B-SPA）。在该策略中，蛋白质的结合位点有效地从粗混合物中“纯化”出活性化合物，允许快速结构评估许多并行的多步反应，并提供即时的结构-活性关系图，而无需传统纯化。

总之，灵敏的生物物理技术对于可靠检测弱结合片段至关重要。方法的选择取决于靶点特性和资源，并且通常结合使用以避免遗漏可行的片段。一旦识别出命中物，它们就进入验证和表征阶段。

4. 命中验证与表征

片段命中物需要彻底验证，包括通过正交方法确认、估计其亲和力以及关于靶点-片段相互作用的详细结构信息。

典型的验证工作流程包括：

I. 使用主要检测方法对命中物进行单独重新筛选。

II. 在一个或多个次级检测中进行测试（例如，来自NMR的命中物通过SPR或晶体学验证，反之亦然）。方法之间的一致性至关重要，因为许多初始命中物是假阳性。

III. 在可能的情况下，晶体学是金标准。X射线共晶结构主要提供关于结合模式和位点的明确见解。即使通过其他方法发现的命中物也经常被浸泡到晶体中进行验证。

IV. 如果无法获得晶体结构，可以通过突变分析或通过目录进行结构-活性关系（SAR）研究间接推断结合。这种方法涉及测试一小组（内部和/或商业）类似物以快速探索命中物周围的化学空间。现在，先进的策略甚至可以在不纯化最终化合物的情况下实现这一点；例如，通过解离速率筛选（Off-rate Screening, ORS），其中使用SPR直接筛选粗反应混合物，根据解离速率对结合物进行排序。

典型的片段命中物较弱（K_D 200 μM–10 mM），但有些达到低μM亲和力或配体效率 >0.3，标志着它们是高质量的命中物。其他技术，如ITC（测量结合热力学）和热位移（ΔT_m）检测（证明蛋白质稳定化），补充验证。验证的另一个方面是检查假象行为：可以通过各种实验剔除聚集、粘性或反应性的片段。例如，NMR是评估化合物溶解度和聚集的直接方法，而基于 detergent 的检测或LC-MS分析可以分别检查非特异性结合和共价加合物。

仔细的库管理至关重要，因为片段筛选极易受到假象的影响。即使有严格的质量控制，意外行为仍可能出现，这使得正交命中验证至关重要。然后通过化学型对验证的片段进行聚类，并探索初始SAR。即使是最小的SAR（即测试几个类似物）也可以确认口袋特异性并为优化提供信息。随着片段筛选通过自动化MS、高通量X射线晶体学和DELs等方法急剧扩展，验证的概念正在从纯粹的实验性、顺序方法发展为将计算预验证与快速、正交的生物物理检查相结合的集成工作流程。

如前所述，合成可及性至关重要：可以容易地细化的片段被优先考虑。极性、未功能化的片段可能结合良好但可能难以优化。在此阶段与药物化学家合作将有助于识别“生长向量”，即用于进一步化学扩展的位点。此外，AI和LM辅助的计算工具（对接、药效团映射、分子动力学）有助于映射片段相互作用，并建议片段生长、合并或连接的策略。团队通常根据新颖性、可处理性和战略契合度选择2-6个验证的命中物进行进一步优化。

5. 片段演化：生长、合并、连接（及混合）策略

将低亲和力片段命中物演化为强效先导化合物是FBDD中称为片段到先导（Fragment-to-Lead, F2L）优化的关键阶段。该过程通常由结构指导的设计驱动，并采用几种关键的合成策略，包括片段生长、连接、合并和混合方法。

5.1. 片段生长

在结构数据的指导下，向片段逐步添加原子或基团，以改善互补性和亲和力，同时保留核心结合模式。例如，Kirsch等人描述了通过点击化学将咪唑片段扩展为三唑抑制剂（IC₅₀ 17 μM），并提高了配体效率。生长可以在有或没有结构信息的情况下进行，但结构指导的方法更有效。

5.2. 片段连接

如果两个片段结合到相邻或接近的位点，它们可以被连接形成高亲和力分子。这种方法，以BCL-XL抑制剂为例，可以 dramatically 提升效力（通常100-1000倍）。然而，它现在通常被认为是最具挑战性的片段到先导方法。困难在于设计一个连接子，以保持两个原始片段的最佳结合几何结构，这需要精确的结构信息，并且通常导致分子具有复杂的合成路线和不太有利的物理化学性质。这种挑战性策略最近的一个成功例子是开发了一种分子胶，可稳定14-3-3/ERα蛋白-蛋白相互作用。在这项工作中，一个共价“系链”片段和一个非共价片段被共结晶，提供了精确的结构信息，指导了连接子的设计，以创建一个强效的非共价先导化合物，同时很大程度上保留了两个片段的原始结合模式。

5.3. 片段合并/支架跃迁

在片段合并中，结合到重叠位点（或共享子结构）的片段命中物被合并（合并）成一个单一的、新的化学型，保留原始片段的关键相互作用。类似地，支架跃迁涉及在保留关键相互作用点的同时替换核心支架，这是改善结合、增强物理化学性质或获取新知识产权的常见策略。

5.4. 混合方法

通常，多种策略被结合使用，例如，生长片段的一端，连接到另一个，或合并特征。计算方法可以提出此类混合体。在每一步，结构验证对于确认所需的结合模式和确保有效进展至关重要。

5.5. 其他考虑因素

无论选择何种演化策略，整个F2L过程都受几个实际考虑因素支配。在整个优化过程中，核心药物化学原则，如维持有利的代谢谱和避免有毒 motif，至关重要。使用LE和LEAT等指标密切监控效率，因为LE的下降可能预示着增加分子大小时收益递减。此外，合成可及性仍然是一个关键约束；有时稍微效力较低但更易于化学处理的片段更适合推进。这些原则通常有利于片段生长和合并，因为片段连接可能在维持最佳结合几何结构和实现直接合成方面带来重大挑战。最后，各种计算机方法对于成功开发先导化合物至关重要，包括用于识别关键相互作用区域的热点分析、用于探索商业可用类似物的SAR by catalogue，以及用于筛选理想ADMET性质的ML模型。

6. FBDD精选案例研究

三个代表性案例说明了FBDD的力量和重要性，强调了结构数据、细致的化学（如优化连接子和官能团）以及准备接受非常规策略（如共价系链）的关键作用。

6.1. B-RAF抑制剂 Vemurafenib (PLX4032)

通过从初始低亲和力命中物进行片段生长开发为强效药物。致癌激酶B-RAF-V600E（黑色素瘤的驱动因子）是首批通过FBDD处理并产生FDA批准药物的靶点之一。Plexxikon的研究人员进行了片段筛选（使用X射线和生化检测），并鉴定出一个7-氮杂吲哚片段（片段1），该片段结合在BRAF活性位点。虽然弱，但该片段在ATP结合口袋中提供了一个立足点。使用迭代的结构指导生长，团队添加了官能团以与邻近的子口袋相互作用。值得注意的是，该片段和一个早期类似物与BRAF共结晶以指导设计（PDB ID 3OG7）。经过多个周期，该片段被细化为PLX4032（Vemurafenib），一个约500 Da分子量的nM级亲和力抑制剂。Vemurafenib在BRAF突变型黑色素瘤中显示出前所未有的疗效，并于2011年获得FDA批准。这个案例体现了由X射线晶体学指导的片段生长：初始片段的结合模式在整个演化过程中得以保留，通过仔细添加环和取代基，同时监测激酶选择性和药代动力学，开发出了口服药物。Vemurafenib的发现验证了FBDD的承诺；它是直接源于片段命中的首批药物之一。有趣的是，一个类似的氮杂吲哚片段被阿斯利康独立用于一个AKT激酶项目，突显了同一个片段可以孕育多个先导化合物。

6.2. BCL-2抑制剂 Venetoclax (ABT-199)

通过片段连接实现，其中两个结合在BCL-2上相邻位点的片段被连接起来，创建了一个高度强效和选择性的药物。抗凋亡蛋白BCL-2长期以来被认为是一个困难的靶点（浅蛋白-蛋白界面）。Abbott科学家在21世纪初应用了SAR by NMR，鉴定出两个小片段（3和4），它们结合在BCL-XL（BCL-2的同源物）上 distinct 但相邻的口袋。一个片段结合P2口袋，另一个结合蛋白质BH3结合沟的P4口袋。在NMR映射和随后的晶体结构指导下，他们用适当的间隔基连接了这些片段（化合物5）。连接的化合物ABT-263对BCL-XL/BCL-2显示出低nM亲和力。进一步优化（以改善药代动力学和对BCL-2的选择性）导致了ABT-199（Venetoclax）。Venetoclax于2016年获批用于慢性淋巴细胞白血病，成为靶向蛋白-蛋白相互作用的突破。其成功源于片段连接策略通过组合弱结合物实现了效力的巨大飞跃。随后的晶体结构证实Venetoclax占据了BH3结合沟，其结构跨越了最初由每个片段靶向的子位点（PDB ID 6O0K）。这个案例也突显了一个重要教训：片段连接可能产生更大的分子；Venetoclax是一个相对较大（MW ~868）且疏水的化合物，推高了口服类药性质的上限。开发团队通过优化代谢稳定性和使用最小长度的连接子取得了成功。Venetoclax的开发是FBDD的一个里程碑，表明即使是细胞内蛋白-蛋白相互作用也可以通过适当连接片段命中来处理。

6.3. KRAS-G12C抑制剂 Sotorasib (AMG 510)

开创了共价片段基础和混合优化（生长和合并）策略，靶向一个高度挑战性的致癌突变体。KRAS G12C是一个小的GTP酶突变体，长期被认为是“不可成药”的。FBDD在最终攻克这个靶点中发挥了关键作用。在2010年代中期，片段筛选（包括共价系链和传统方法）鉴定出小的半胱氨酸反应性片段（6和7），它们结合在突变Cys12旁边的一个可诱导口袋（Switch-II沟）中。一个这样的片段是一个丙烯酰胺（7），它共价结合Cys12并占据了部分口袋。通过基于结构的设计，片段被生长（ABS-1620和化合物10）和合并以填充相邻口袋，同时保留共价弹头。这导致了强效抑制剂， exemplified by AMG 510，称为Sotorasib（通过FBDD开发）和MRTX849，称为Adagrasib（使用基于结构的药物设计方法），两者均在2021-2022年获批用于KRAS突变的肺癌。这些抑制剂本质上是从一个最初共价系链的片段构建的更大分子。KRAS G12C项目展示了片段方法（共价片段筛选结合传统药物化学）如何在一个先前认为不可接近的靶点上打开了一个新的结合位点。它还强调了整合计算建模的价值：量子力学建模支持了占据隐蔽口袋的最佳片段和连接子的设计。Sotorasib的成功激励了针对其他挑战性癌基因的FBD