基于超滤浓度比归一化的分泌蛋白质组分析方法优化及其在核DNA诱导炎症研究中的应用

本研究针对传统BCA法在浓缩培养基蛋白质定量中的高估问题，开发了基于超滤浓度比的体积调整新方法。研究人员通过核DNA(nucDNA)转染HeLa细胞模型，建立浓度率标准化方案，成功鉴定3468个分泌蛋白，发现89个差异释放蛋白，并鉴定出伴侣蛋白和蛋白酶体复合物作为潜在内参。该研究为分泌组分析提供了可靠方法学支持，相关成果发表于《Biology Methods & Protocols》。

　　

细胞间的"分子对话"一直是生命科学研究的核心命题，而分泌蛋白质组(secretome)作为细胞通讯的重要媒介，其精准解析对理解生理病理机制至关重要。然而在这个充满潜力的研究领域，却隐藏着一个长期被忽视的方法学陷阱——传统BCA蛋白定量法在分析浓缩培养基时会产生系统性高估，导致质谱分析中蛋白上样量不一致，严重影响数据可靠性。这个问题就像一把"双刃剑"，既制约着基础研究的准确性，也阻碍着基于分泌蛋白的生物标志物开发和治疗策略研究。

Takayoshi Otsuka等研究团队在《Biology Methods & Protocols》发表的这项研究，正是针对这一关键技术瓶颈展开攻关。研究人员独具匠心地选择了核DNA(nucDNA)诱导的炎症模型作为方法验证体系，这不仅因为基因组不稳定性是衰老的标志之一，更因为胞质DNA泄漏会通过cGAS-STING通路引发炎症反应，为分泌组变化提供了理想的研究场景。通过对比传统BCA法和新型浓度率标准化方法，研究团队揭开了浓缩培养基中干扰物质导致蛋白定量偏差的"黑箱"，为领域内建立了一套更可靠的分泌组分析流程。

关键技术方法方面，研究主要采用：1)核DNA纯化与转染技术建立炎症模型；2)基于超滤浓度比的体积调整方法替代传统BCA定量；3)数据非依赖性采集(DIA)质谱技术进行蛋白质组分析；4)qPCR和Western blot等多层次验证体系。实验使用野生型HeLa细胞及CRISPR-Cas9构建的cGAS缺陷型(164-6)和IFI16缺陷型(162-5)细胞系。

"炎症反应由核DNA转染引发"部分，研究通过精巧的实验设计证实：转染的nucDNA形成明显的胞质 puncta（黄色箭头指示），与组蛋白H2B标记的核DNA及HSP60标记的线粒体区截然不同。在野生型HeLa细胞中，nucDNA转染显著诱导IL6和IL8 mRNA表达，而cGAS或IFI16缺陷细胞则显示下调趋势。特别是cGAS通路下游分子ISG15的表达模式，完美印证了该通路在DNA感应中的特异性。

"通过浓度率为基础的体积调整实现改进的样品制备"部分揭示了传统BCA法的重大局限：银染显示培养基样品的实际蛋白量远低于BCA测定值。而创新的浓度率计算法（初始体积/最终浓缩体积）使蛋白上样一致性得到显著改善。这种方法基于超滤过程中蛋白截留与小分子滤过的基本原理，避免了化学检测中的干扰问题。

"蛋白质组数据的验证"部分展示了方法优化的丰硕成果：鉴定到4771个蛋白，过滤后保留3468个高置信度分泌蛋白，样本间Pearson相关系数r>0.93。PCA分析和层次聚类清晰区分nucDNA转染与对照组，发现89个差异释放蛋白(DRPs)，其中39个上调、50个下调。这些结果与qPCR(IL6、ISG15)、ELISA和Western blot数据高度一致，形成多维度验证闭环。GO分析显示"伤口反应"、"外界刺激响应"等通路显著激活，而"细胞外基质组织"相关蛋白下调，揭示了nucDNA影响细胞微环境的新机制。

"分泌组中潜在内参的探索"可能是最具转化价值的发现。研究人员计算出所有蛋白的变异系数(CV)，发现传统看家基因PGK1(CV=0.00516)、TUBB(CV=0.00549)等在分泌组中仍保持稳定。更引人注目的是，CV<0.005的蛋白显著富集在伴侣蛋白和蛋白酶体复合物中，这些高丰度胞内蛋白可能通过基础分泌或微量细胞泄漏进入培养基，其稳定性为分泌组分析提供了潜在标准化参照。

这项研究在方法论层面解决了分泌组分析的关键痛点，其创新的浓度率标准化策略具有以下突出价值：首先，该方法仅需体积测量即可实施，成本低廉且易于推广；其次，通过银染质控可有效避免血清白蛋白污染等问题；更重要的是，研究提出的潜在内参蛋白为领域建立了标准化基础。尽管在细胞增殖差异较大时存在局限，但该方法在大多数比较研究中展现出强大适用性。

正如作者在讨论中指出的，这项技术突破不仅为核DNA诱导的炎症机制研究提供了可靠工具，更将促进分泌组学在肿瘤微环境、衰老研究、干细胞治疗等领域的应用。特别是鉴定出的稳定分泌蛋白，可能成为未来研究的内参"金标准"。这项研究犹如一把精心打磨的"钥匙"，为打开分泌蛋白质组精准分析的大门提供了关键工具，必将推动相关领域研究进入新的发展阶段。