基于MIL-101(Cr)薄膜的多重荧光微阵列：用于pH和疾病相关分子检测的稳定发光探针

本文介绍了一种通过扫描探针光刻（SPL）和后退弯月面涂层（RMC）技术在金属有机框架（MOF）薄膜上制备多重荧光微阵列的创新策略，成功将溶液中的MOF传感转化为表面检测，解决了传统方法中预处理复杂和稳定性差的问题。该染料@MOF（dye@MOF）微阵列在分析物溶液中表现出良好稳定性，对pH 5–9范围敏感，并结合主成分分析（PCA）实现了多巴胺（DA）与其他代谢物的区分，为流体环境中小分子分析物的稳定微阵列检测提供了新途径。

　　

摘要

近年来，金属有机框架（MOF）在传感领域展现出巨大潜力。然而，基于MOF的溶液荧光检测需要复杂的预处理且存在稳定性问题，限制了其实际应用。本研究引入了一种易于操作、低成本的策略，通过扫描探针光刻（SPL）将MOF传感从溶液转化为表面检测。利用后退弯月面涂层（RMC）将MOF固定于表面，再通过微通道悬臂点样（μCS）在MOF薄膜上图案化荧光染料，形成稳定的染料@MOF（dye@MOF）荧光微阵列。该微阵列在pH 5–9范围内表现出良好的pH敏感性，并结合主成分分析（PCA）能够从溶液中区分多巴胺与其他三种代谢物。这一概念为流体环境中小分子分析物的稳定微阵列检测提供了新方法。

1 引言

金属有机框架（MOF）因其在气体存储/分离、催化、分析化学等领域的应用潜力而备受关注。其可调的孔径和结构多样性赋予了其对多种分子的特异选择性和敏感性，这是其他材料难以实现的。基于这些结构优势，研究人员通过优化孔径和形状、功能化框架以及调节金属节点配位等方式开发了MOF传感平台。例如，Herm等人合成的Fe₂(BDP)₃ MOF因其独特的三角形通道而对己烷异构体具有吸收选择性。MOF基荧光化学传感器因其合成简单且可通过选择不同染料调节发射特性而日益流行。MOF的本征孔隙度和高度有序结构为宿主发光客体分子提供了受限环境，增强了分析物相互作用，从而提高了传感性能。

然而，大多数MOF基荧光化学传感器在液体环境中工作，需要适当且仔细的制备以避免引入显著误差。例如，使用前需通过彻底超声处理形成稳定悬浮液或乳液，以防止因表面浓缩位点吸收更多入射光而导致的潜在误差。此外，颗粒在激光束中的漂移会导致强度波动。将荧光检测过程从溶液转移到表面可以消除溶液中的制备步骤，并减少由浊度引起的误差可能性。因此，开发具有荧光的MOF薄膜是溶液中检测的更好替代方案，且需要能够提供良好结构控制并适用于大面积的方法用于表面传感应用。

另一方面，染料@MOF化学传感器制备中使用的合成荧光染料量需加以考虑，因为许多常见有机染料（如罗丹明B和亚甲基蓝等）若未经科学处理可能成为水中的有毒污染物。基于扫描探针光刻（SPL）的技术能够以纳米级精度直接在各种材料上图案化染料，将染料溶液的使用减少到飞升规模。染料溶液通过SPL渗透到MOF薄膜中形成染料@MOF荧光点，赋予表面潜在的荧光传感功能。SPL还可轻松获得荧光点微阵列。微阵列中的每个点相互独立，允许在单一步骤中获得样品上的重复测量结果集合，这比比色皿中一次只能产生一个数据的测量过程更为快速。此外，SPL方法可以将几种具有不同结构或发射特性的指示剂集成到一个基底上形成阵列传感器，提供多个传感元件的并行读出。当与主成分分析（PCA）结合时，这种方法提高了MOF基荧光化学传感器的整体选择性，克服了传统传感技术在复杂环境中的局限性。

基于以上原因，我们通过微通道悬臂点样（μCS）在MIL-101(Cr)-NH₂薄膜上图案化四种红色和绿色染料指示剂，开发了一种多重阵列传感系统。MIL-101(Cr)是研究最广泛的MOF之一，具有高水稳定性和化学稳定性，其大孔隙率（12 ?和16 ? × 14.5 ?窗口）和高BET比表面积（>3000 m²/g）使其成为荧光染料的有前途吸附剂。此外，MIL-101(Cr)结构的官能化可以提供更多特异性活性位点以增强主体与荧光染料之间的相互作用。例如，2-氨基对苯二甲酸配体上的-NH₂基团可以增强阴离子染料吸附到MIL-101(Cr)-NH₂上的驱动力（如氢键和静电作用），从而提高吸附能力。通过RMC在玻璃基底上制备了具有优异表面形态的MIL-101薄膜。染料@MOF复合材料在倒置荧光显微镜下表现出优异的荧光强度和良好的稳定性，这归因于MOF结构上的-NH₂基团与染料官能团之间的相互作用。FITC@MIL-101(Cr)-NH₂具有pH依赖性发射，可作为pH指示剂。此外，还测量了染料@MIL-101(Cr)-NH₂复合材料对流体环境中四种神经递质的荧光响应，它们对分析物表现出不同的指纹图谱，具有在溶液中区分疾病相关分子的潜在应用。

2 结果与讨论

2.1 设计与材料表征

设计原理是通过μCS方法在MOF薄膜上获得基于微阵列的荧光传感系统，该系统易于操作和读出，可增加传感器的可重复使用性并减少材料消耗。分析物与荧光探针之间的相互作用可以通过能量或电子转移过程改变荧光材料的光电特性，导致荧光强度或发射光谱峰移的可观察变化。这一现象被广泛认为是荧光传感的基本机制。MOF是荧光探针载体的有前途候选者，因为MOF孔的纳米限制效应可能提高主客体相互作用中能量或电子转移的效率，从而促进荧光化学传感器的灵敏度和选择性。选择MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)-NH₂进行薄膜制备作为染料固定化的基底，因为它们具有适合染料吸收的孔径以及氨基与染料官能团相互作用的可能性以减少染料泄漏。通过μCS进行染料图案化。多项研究表明，μCS是一种将液滴渗透到多孔基底以获得所需图案的有效技术。在μCS中，表面图案化工具（SPT）尖端上的微通道将μL规模的储液器连接到孔径，允许在特定位置持续渗透。由于墨水分子在尖端轻轻接触基底时通过形成的弯月面从尖端转移到基底，因此尖端不会损坏MOF薄膜或留下痕迹。与直接将预合成的染料@MOF固定于表面相比，在MOF薄膜上图案化不需要溶液中的染料@MOF复合材料合成过程步骤，并且可以轻松在一个基底上创建多染料图案以获得多重阵列传感器。

通过水热反应法合成了MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)-NH₂，并通过FT-IR和PXRD验证。FT-IR光谱显示，MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)-NH₂分别在1393和1509 cm^?1或1385和1497 cm^?1处的振动信号与-(O─C─O)-的不对称伸缩有关，表明由于连接体与金属离子之间的配位形成了MOF框架。在MIL-101(Cr)-NH₂的FT-IR光谱中，1619 cm^?1处的峰归因于氨基的N─H弯曲振动，而1338 cm^?1处的信号对应于苯环上C─N键的伸缩振动。3477和3367 cm^?1处的谱带归因于-NH₂的不对称和对称振动。PXRD图谱表明MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)-NH₂的晶体结构与模拟图案高度相似，但具有更宽的布拉格峰反射。通常，XRD的半高全宽与微晶尺寸成反比，即晶体变小而峰变宽。通过SEM确认了MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)-NH₂的尺寸和形态。两种MOF产物均呈现直径约50 nm的多面体结构和近似球形形状。以上结果证明了纳米尺寸MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)-NH₂的成功合成。通过N₂吸附表征了MOF的孔隙率。MIL-101(Cr)的BET比表面积和总孔体积分别计算为2326.54 m²/g和1.32 cm³/g，与文献中的2579 m²/g和1.23 cm³/g值良好吻合。MIL-101(Cr)-NH₂呈现出比合成的MIL-101(Cr)更低的BET比表面积（1746.68 m²/g）和总孔体积（1.04 cm³/g），这是由于有机连接体中-NH₂基团的存在。通过BET计算的吸附平均孔径在MIL-101(Cr)中为2.27 nm，在MIL-101(Cr)-NH₂中为2.38 nm，证明了MOF晶体结构中中孔笼的形成。

2.2 MOF薄膜制备

目前已开发出多种制备MOF薄膜的技术，可分为基于溶液的制备（液相外延、界面合成、基底种子异质外延、电化学沉积和粉末MOF基沉积）和基于真空的制备（化学气相沉积和原子层沉积）。此外，Lee等人首次引入了弯月面引导结晶技术在大面积上生长高质量MOF薄膜。在弯月面引导结晶中，过饱和前体溶液夹在基底和移动刀片之间，MOF的结晶发生在弯月面中以形成薄膜。弯月面引导结晶通过调节实验参数（如涂层速度和基底温度）提供了对晶体堆积密度、薄膜厚度和晶体尺寸的精确控制，证明它是一种在各种基底上制备多种MOF薄膜的简便而强大的技术，可以克服传统MOF薄膜生长方法的障碍。在本研究中，首次采用从弯月面引导涂层改进的后退弯月面涂层（RMC）技术用于MOF薄膜的制备。这里使用合成后的MOF晶体悬浮液代替前体溶液进行涂层过程中的结晶，因为MIL-101的形成需要苛刻的条件（如高温和自生压力）。RMC中使用两个玻璃载玻片，底部作为基底的载玻片经过氧等离子体处理，诱导表面高密度─OH基团以实现MOF悬浮液的良好润湿性和MOF晶体的固定化。这两个玻璃载玻片的左右端通过双面胶带以一定偏移粘合在一起，留下约100 μm的距离（胶带厚度），然后将MOF悬浮液注入两个玻璃载玻片之间，并自然形成弯月面。弯月面中的晶体直接沉积在基底上以获得MOF薄膜。与弯月面引导结晶相比，RMC不需要实际的移动刀片，因为随着溶剂逐渐蒸发，弯月面的液体边缘移动通过整个薄膜，充当“平滑”表面的移动刀片，并将不能立即稳定沉积在表面的过量晶体移动到边缘或角落。这种方法允许通过使用双面胶带在指定位置创建所需形状来一步制备具有所需图案的MOF薄膜，这有助于获得可轻松与其他设备（如微流体通道系统）集成的样品。

旋涂和滴铸常用于MOF薄膜制备，因为其简单性；然而，在控制形态方面存在明显困难，特别是对于大基底，例如所谓的咖啡环效应（当溶液或分散体在表面上干燥时，在边缘或接触线处形成的环状结构，由边缘区域与中心之间的蒸发速率差异引起）在旋涂和滴铸中都会发生，并且滴铸中的薄膜厚度高度不均匀。然而，比较通过不同沉积方法制备的MOF薄膜的照片和显微镜图像，通过RMC制备的薄膜显示出比通过旋涂和滴铸制备的薄膜更高的平整度。从结果来看，RMC中没有咖啡环效应，并且来自弯月面的毛细力提高了薄膜的均匀性，表明RMC是一种简便的技术，具有获得高质量MOF薄膜的潜力，甚至优于旋涂和滴铸。

通过掠入射广角X射线散射（GIWAXS）评估了MOF薄膜的结晶度。由于沉积在表面的少量晶体限制了标准PXRD对MOF薄膜结构分析的有效性，GIWAXS作为一种表面敏感技术，已成为一种优秀的替代方案，有效克服了与PXRD相关的挑战，并实现了MOF薄膜可靠的结晶度表征。GIWAXS图像显示了明显的衍射环，在q≈0.64、0.44、0.28和0.20 ?^?1处有显著特征，分别对应于（753）、（440）、（400）和（220）晶面，这与报道的MIL-101结构高度一致。从GIWAXS数据得出的XRD图谱也与MIL-101的模拟PXRD图谱高度一致，尽管特征峰出现 broadening。这种 broadening 可能是由于基底上沉积的材料量有限，以及GIWAXS分析固有的峰 broadening。这些结果表明，MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)-NH₂的晶体结构在薄膜制备后得到了很好的保留。通过SEM表征了通过RMC制备的MOF薄膜的表面形态。根据图像，两种MOF在薄膜制备后保留了其原始结构，如图中合成的晶体所示。与MIL-101(Cr)-NH₂相比，MIL-101(Cr)薄膜表现出更致密和更均匀的颗粒分布，没有大空隙，而在MIL-101(Cr)-NH₂薄膜中观察到尺寸达几微米的空位，这可能归因于由于MOF框架上的胺官能团而发生的晶体团聚。使用3D光学轮廓仪评估了MOF薄膜的粗糙度和厚度，该仪器应用光学探针通过感测表面上的最佳聚焦位置来表征表面形态，而不是接触测试表面的机械探针。MOF薄膜的3D表面图像由表面上每个点的高度数据集合生成，整个场的均方根高度计算为MIL-101(Cr)薄膜3.28 μm和MIL-101(Cr)-NH₂薄膜3.57 μm。薄膜的整体厚度分别约为MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)-NH₂薄膜13和16 μm。所有获得的MOF薄膜在微米尺度的表面形貌特征证明了它们通过μCS印刷数十或数百微米范围特征的实用性，使它们成为适用于微阵列的基底。

2.3 通过μCS进行图案化

成功获得MOF薄膜基底后，下一步是通过μCS微图案化将染料作为荧光探针引入MOF框架。荧光有机染料由于其固有的选择性和高荧光量子产率而被广泛用作荧光化学传感器中的发色团。在各种有机染料中，那些具有红色和绿色发射的染料（如荧光素和罗丹明）易于可见，已被广泛研究用于传感应用。因此，本研究选择了四种具有琥珀酰亚胺酯或异硫氰酸盐官能团的典型红色和绿色荧光染料衍生物，这些官能团可以与MOF连接体上的氨基反应：德克萨斯红X（TR X）NHS酯、罗丹明NHS酯、花青3 NHS酯和荧光素异硫氰酸盐（FITC），它们的结构如图所示，与氨基的反应公式如图所示。它们具有不同的结构或官能团，可能对分析物表现出不同的亲和力，并且它们的分子尺寸与MIL-101的窗口尺寸匹配，允许它们进入MOF的孔中。这些染料在倒置荧光显微镜下在MIL-101(Cr)或MIL-101(Cr)-NH₂中表现出良好的荧光强度。记录了涂覆在玻璃表面和并入MOF薄膜中的染料的荧光光谱，以研究其荧光特性的变化。所有光谱均用玻璃或MOF薄膜的信号进行背景扣除，然后归一化。在所有染料@MOF的光谱中观察到发射峰的红移，表明染料与MOF框架之间存在相互作用。此外，花青3 NHS酯和TR X NHS酯的发射光谱在并入MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)-NH₂后变宽，进一步证明了其荧光特性的改变。然后，通过随后接触装载有染料墨水的SPT尖端，并控制停留时间和湿度，在MOF薄膜中获得了间距为300 μm的5 × 5荧光微阵列。每个点重复几次以确保墨水的饱和渗透以获得微阵列的最高强度，并在孵育后洗去过量的墨水。如图所示，所有染料均以理想的荧光强度固定在MOF薄膜上作为微阵列。MIL-101(Cr)薄膜上的点尺寸大于MIL-101(Cr)-NH₂上的点尺寸，这是由于粗糙度和晶体排列密度差异导致的MOF薄膜润湿性不同。通过测量表面多个位置的水接触角（WCA）来表征MOF薄膜的润湿性。表面的粗糙度会影响其润湿性，导致比在相同组成但更光滑纹理的表面上观察到的WCA更高。此外，表面上的化学异质性可以钉扎接触线，从而限制液体铺展的程度。从WCA图像来看，水滴 upon contact 迅速渗透到MIL-101(Cr)薄膜中，而水滴保留在MIL-101(Cr)-NH₂表面上，表现出范围从18°到59°的WCA。因此，在印刷后和洗涤后拍摄的图像之间，MIL-101(Cr)薄膜中四个染料点的尺寸略有减少，因为过量的墨水被洗掉。在24小时孵育和洗涤后，MIL-101(Cr)-NH₂薄膜上的点比刚印刷后稍大，因为墨水在存在甘油以减缓溶剂蒸发的情况下作为液滴保留在MIL-101(Cr)-NH₂薄膜表面上一段时间，并且墨水的渗透进入MOF薄膜发生在整个印刷和孵育过程中。点的中心更亮，边缘的强度最弱，因为渗透方向是从中心（尖端接触处）到周围。以上结果表明，可以通过μCS在MOF薄膜中实现荧光微阵列。此外，点的尺寸和形状是可设计的，因为它们不受洗涤和孵育步骤的影响。由于墨水在印刷过程中向下渗透到MOF薄膜中，并且未结合的染料分子被彻底洗掉，通过共聚焦显微镜可视化了结合到框架或浸渍在多孔结构内的染料在薄膜中的3D分布。红色发射染料深入渗透到MIL-101(Cr)薄膜中（7.6-15.2 μm），而FITC仅达到约7.3 μm。在MIL-101(Cr)-NH₂薄膜中，花青3 NHS酯和罗丹明NHS酯表现出比TR X NHS酯和FITC（分别为12.9和14.0 μm）更大的渗透深度（分别为23.0和21.2 μm）。

原则上，所有染料均与MIL-101(Cr)-NH₂的连接体共价结合，而它们仅通过非共价相互作用（如π-π相互作用和MOF孔的限制）固定在MIL-101(Cr)上，因此结合强度较弱，染料分子更容易泄漏。由于制造的染料@MIL-101(Cr)荧光微阵列旨在用于流体环境中的检测，但在使用前在干燥条件下储存，因此传感过程中的荧光稳定性（主要受染料从MOF框架泄漏的影响）对其性能至关重要。因此，研究了在传感测量持续时间内磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的染料泄漏。将图案化的样品用乙醇和水彻底洗涤以去除表面上游离的过量染料分子，然后浸入PBS（pH 7.4）中15分钟以获得荧光图像。浸没时间与检测测量持续时间一致。测量每个荧光点的像素强度（PI）用于后续分析。染料@MIL-101(Cr)和染料@MIL-101(Cr)-NH₂在PBS中每个循环后的相对PIs如图所示。MIL-101(Cr)薄膜中花青3、罗丹明NHS酯和FITC的强度在第一个循环后降至约50%。花青3 NHS酯@MIL-101(Cr)在五个循环后损失了约90%的强度，而FITC@MIL-101(Cr)和罗丹明NHS酯@MIL-101(Cr)在后续循环中强度变化很小，分别在五个循环后保留44%和30%的强度。TR X NHS酯@MIL-101(Cr)的强度与其他三种相比最稳定，最终仅下降37%。对于MIL-101(Cr)-NH₂，共价键合极大地鼓励了染料@MIL-101(Cr)-NH₂复合材料在溶液中的稳定性。五个循环后，FITC@MIL-101(Cr)-NH₂的强度几乎保持不变，并且TRX NHS在MIL-101(Cr)-NH₂薄膜中的泄漏可忽略不计，仅下降8%。尽管其他两种染料@MIL-101(Cr)-NH₂复合材料的强度在循环过程中仍然略有下降，但它们逐渐稳定，两个循环之间没有显著变化。所有结果表明，染料对MIL-101(Cr)的亲和力不足以在溶液中维持稳定的结合状态，这将影响传感结果的准确性，而染料在MIL-101(Cr)-NH₂薄膜中的泄漏在可接受范围内，可以在流体环境中工作，特别是在初始调节以去除第一个PBS循环中剩余未结合染料分子之后。此外，荧光探针在溶液中的长期稳定性对其在液体检测中的实际应用也至关重要。为了评估这一点，将染料@MIL-101(Cr)-NH₂微阵列在彻底洗涤以去除未结合染料后暴露于PBS中五天，并每天记录它们的荧光强度。结果如图所示，所有染料@MIL-101(Cr)-NH₂复合材料在五天内表现出可忽略的荧光强度变化。这些结果表明，印刷的染料@MIL-101(Cr)-NH₂荧光微阵列在水环境中具有良好的稳定性，支持它们在流体样品分析中可靠和延长使用的潜力。

2.4 pH敏感性和缓冲液中疾病相关分子的检测

生物流体的生理pH在体内保持恒定，并受代谢和肺通气调节，因此是评估健康状况的因素之一。由于FITC在pH 5–9范围内表现出pH依赖性荧光发射，许多研究人员利用FITC或其复合材料作为生物条件（如活细胞）中的pH探针。相反，罗丹明、花青3和TR被证明在生理pH条件下对pH不敏感。因此，还研究了染料@MIL-101(Cr)-NH₂在pH 5–9范围内的pH敏感性。对于每个样品，在水中测量PIs作为PI₀，在不同pH的PBS中测量作为PI。使用PI和PI₀的比率进行比较，以消除样品之间不同初始荧光强度的影响。FITC@MIL-101(Cr)-NH₂的荧光强度随着pH从5升高到9而增加，与文献中报道的FITC的pH依赖性趋势一致，而其他染料显示强度没有明显变化，表明染料与MOF之间的组合没有改变染料的pH选择性，并且FITC@MIL-101(Cr)-NH₂可以作为生物流体样品在pH 5–9范围内的pH探针，而其他三种可以作为没有pH敏感性的基于阵列传感的参考。

多巴胺（DA）是一种神经递质，在神经、心血管和激素系统中起着重要作用，其异常水平通常与某些疾病相关，如高血压、抑郁症、帕金森病和精神分裂症。因此，检测生物流体中的DA有助于了解身体状况并早期发现相关的神经和心血管疾病，并且许多努力致力于DA的特异性识别，因为它总是与其类似物和一些潜在的干扰物一起存在于生物样品中，使其检测复杂化。FITC显示出其在溶液中检测DA的能力，由于FITC的异硫氰酸盐基团与DA的NH₂基团之间的特异性相互作用，以及FITC和DA分子之间的H键和π-π堆积。这些相互作用导致FITC的荧光强度发生变化。Thomas等人证明了罗丹明B和DA之间的静电相互作用，这可能潜在地增强DA的敏感性。因此，在本研究中，选择DA作为目标分析物，并使用基于阵列的传感在微流体通道系统中研究了染料@MIL-101(Cr)-NH₂对DA的定量检测能力。基于染料@MIL-101(Cr)-NH₂的DA检测荧光传感阵列如图所示。在含有不同浓度DA的PBS中进行荧光测量，并记录每个微阵列点的PI作为单独读出。这里，PI_A和PI分别代表存在和不存在分析物时染料@MIL-101(Cr)-NH₂的PI，并且使用PCA进一步分析了四种复合材料的PI_A/PI值。如图所示，从PCA结果中获得的第一主成分（PC1）与10–50 μm范围内的DA浓度呈线性关系，检测限（LOD）为9.19 μm，定量限（LOQ）为27.86 μm，证明了染料@MIL-101(Cr)-NH₂在微摩尔范围内定量检测DA的能力。FITC@MIL-101(Cr)-NH₂已被证明对pH敏感，而DA包含一个伯氨基和两个酚羟基，所有这些在溶液中都表现出pH依赖性H键行为。此外，MOF复合材料与分析物之间的静电相互作用也随pH而变化。因此，FITC@MIL-101(Cr)-NH₂在不同pH值下暴露于50 μm DA时的荧光响应如图所示。由于荧光响应可能受FITC@MIL-101(Cr)-NH₂和DA之间的多种非共价相互作用（包括H键和静电相互作用）控制，并且H键不是主要驱动力，因此未观察到荧光强度变化与pH之间的明确相关性。在不同pH下对DA的一致响应也表明FITC@MIL-101(Cr)-NH₂在pH 5至9范围内的功能稳定性。此外，使用加标溶液与单个分析物（包括DA和潜在干扰物：抗坏血酸（AA）、左旋多巴（L-DOPA）和去甲肾上腺素（NE））进行了区分测试。在生理条件下，神经和体液中的DA浓度通常在0.01至1 μm范围内。在患有阿尔茨海默病的老年患者中，血浆