基于机理建模的混合模式膜色谱优化与放大：新型膜吸附剂在抗体电荷变体分离中的应用

本综述系统探讨了混合模式膜色谱（Mixed-mode membrane chromatography）在单克隆抗体（mAb）电荷变体分离中的创新应用。研究通过建立精确的机理模型（包括化学计量置换模型和空间质量作用模型），成功优化并验证了新型Natrix? CH膜吸附剂的高分辨率分离性能。该膜结合了阳离子交换（CEX）和疏水相互作用（HIC）功能，在较高盐浓度（约0.1 mol·L?1）下仍表现出优异选择性。研究还实现了从实验室规模（1.06 mL）到中试规模（8.8 mL）的线性放大，即使在高达10 MV/min的流速下，动态结合容量（DBC）仅下降7%，显著提升了纯化通量和效率，为生物制药下游处理提供了高效、可放大的替代方案。

　　

引言

单克隆抗体（mAb）已成为现代医学领域的核心治疗手段，广泛应用于癌症、自身免疫性疾病和传染病的治疗。然而，mAb的生产和纯化过程面临诸多挑战，尤其是蛋白质异质性（如聚集体、糖基化或电荷修饰）可能影响最终产品的效力、稳定性和安全性。传统的树脂色谱技术虽有效，但存在处理时间长、成本高以及由于扩散限制的质量传递和需要大柱体积而带来的放大问题。近年来，膜色谱作为一种有前景的替代技术脱颖而出，其通过实现高速流动下的高通量分离，解决了树脂色谱的某些局限性。

膜吸附器在生物制药领域越来越受到关注，可用于流穿模式或结合-洗脱模式的应用。在流穿模式中，它们作为去除杂质（如宿主细胞蛋白、DNA和病毒污染物）的有效工具，而目标mAb则不受影响地通过。最近的研究通过将膜吸附器与单次切向流过滤相结合，开发了流穿式mAb纯化工艺，实现了DNA（<2 ppm）和宿主细胞蛋白（<29 ppm）的高效去除，且产率较高，通量比传统填充床色谱高36倍。膜色谱的最新进展集中在提高膜吸附剂的性能和多功能性上，例如开发新型材料（如纳米纤维基支架和水凝胶载体）以改善结合容量和选择性。这些创新使得动态结合容量（DBC）与树脂基材料相当，同时保持更短的停留时间。

此外，新型混合模式膜的出现引起了特别关注，因为它们结合了不同的吸附分离机制，从而提高了对特定溶质的选择性。例如，Stein等人开发了一种简化的混合模式膜吸附器设计方法，用于优化mAb聚集体去除，通过高通量筛选鉴定出配体，表现出卓越的选择性、结合容量和耐盐性，优于基于珠子的系统。这些技术越来越多地与机理模型结合以优化工艺。机理建模已被应用于预测多模式阳离子交换系统的行为，从而实现对电荷变体分离的精确控制。

本研究旨在使用机理建模工具表征和优化新型混合模式膜上mAb电荷变体的分离。成功实施混合模式膜色谱用于mAb电荷变体分离需要深入理解潜在的分离机制，这正是机理建模的优势所在。它提供了关于mAb与膜材料之间复杂相互作用的宝贵见解，有助于优化分离过程并提高整体效率。机理建模还有助于预测不同操作条件下分离过程的性能，促进工艺开发和放大。

理论考量

化学计量置换模型

在离子交换色谱中，蛋白质和反离子之间的交换反应及其与配体的相互作用可以通过化学计量置换模型来描述。该模型的关键特征包括特征电荷数（ν）和热力学平衡常数（K），这些参数通过实验数据拟合获得。蛋白质吸附平衡由空间质量作用（SMA）模型描述，该模型包含了 steric shielding factor（σ），解释了由于蛋白质结合引起的空间位阻导致的固定相上相邻结合位点的阻塞。SMA模型通过结合这些因素，提供了对蛋白质在离子交换过程中吸附行为的详细描述。

线性梯度洗脱实验

线性盐和pH梯度洗脱实验用于评估蛋白质在低负载条件下的行为。通过测量蛋白质洗脱时的修饰剂浓度（如盐浓度或pH值）与标准化梯度斜率之间的关系，可以计算出分布系数（K_D）和其他模型参数。这种方法基于Yamamoto和Pedersen等人的工作，适用于pH梯度或盐梯度洗脱。

柱模型

采用集总速率模型（即传输分散模型）来模拟膜内的蛋白质分布和修饰剂浓度。该模型将所有内部和外部传质阻力汇总为一个集总膜传质系数，并假设其与轴向分散无关。通过线性驱动力近似描述流动相和固定相之间的传质。

材料与方法

膜

本研究使用的Natrix? CH膜是一种阳离子交换和疏水相互作用色谱膜，结合了磺酸基（强阳离子交换）和叔丁基（疏水相互作用）功能。它由聚丙烯酰胺水凝胶增强聚对苯二甲酸丁二醇酯制成，设计用于高速处理。该膜支持高达10膜体积（MV）/分钟的流速和最大5 bar的压力。根据制造商数据，它在pH 7和0.02 mol·L?1磷酸钠条件下对溶菌酶的DBC >90 mg·mL_MV?1，对mAb的DBC >80 mg·mL_MV?1。膜以平片形式提供，体积为1.06 mL（实验室规模）和8.8 mL（中试规模），膜吸附材料来自同一批次以确保可比性。

样品

使用mAb02（c = 6.95 mg·mL?1），这是一种由Merck Life Science KGaA提供的单克隆抗体，已通过Protein A色谱进行初步纯化。抗体样品主要由单体物种（>98.5%）组成，含有少量高分子量物种。通过阳离子交换色谱（CEX）鉴定了mAb02的 distinct电荷变体，根据其等电点分为酸性（pI ≈ 8.15）、中性（pI ≈ 8.30）和碱性（pI ≈ 8.45）变体。使用Eshmuno? CPX树脂将这些变体分离并富集成三个高度富集的池：酸性变体池（最终浓度1.07 mg·mL?1，纯度93.5%）、中性变体池（1.80 mg·mL?1，纯度76.7%）和碱性变体池（1.59 mg·mL?1，纯度79.4%）。

色谱

制备分离和线性梯度洗脱实验使用?KTApurifier? 100色谱系统进行，蛋白质样品使用?KTAmicro?系统分析。Natrix? CH膜（V = 1.06 mL）用于建模实验，Sartobind? S阳离子交换膜（V = 2.1 mL）用于比较。UV信号在280 nm波长处测量。

阳离子交换高效液相色谱（CEX-HPLC）

电荷变体分析使用CEX-HPLC进行。固定相为YMC-BioPro SP-F柱（4.6 mm内径 × 50 mm长度），流速0.8 mL·min?1。缓冲液A（平衡缓冲液）由0.0088 mol·L?1乙酸、0.01 mol·L?1 MES、0.0155 mol·L?1 MOPSO、0.0225 mol·L?1 NaCl组成，调节至pH 5.0。缓冲液B（洗脱缓冲液）包含0.0184 mol·L?1 HEPES、0.0072 mol·L?1 TAPS、0.0077 mol·L?1 CHES，用NaOH调节至最终pH 9.5。洗脱从35%到80% B在27柱体积内进行。

线性梯度洗脱实验

对每个变体池进行线性梯度洗脱实验，使用不同的梯度斜率。这些实验包括多个pH梯度（4.5至9.0），钠离子浓度保持在0.06至0.2 mol·L?1之间。通过混合pK_a值在目标pH范围内的缓冲物质，迭代微调浓度以实现一致的缓冲容量，从而产生线性滴定曲线和线性pH梯度。盐梯度在恒定pH水平（4.5和5.0）下进行，从0.03到0.8 mol·L?1钠离子。梯度体积在65到140 MV之间变化，流速设置为10 mL·min?1。蛋白质负载保持在0.6 mg·mL_MV?1。对于高负载研究，蛋白质负载逐渐增加至35 mg·mL_MV?1，并进一步升高至300 mg·mL_MV?1用于DBC测量。

使用机理建模进行参数估计

通过提取峰质心处的pH和钠离子浓度（使用Python 3的lmfit模块通过EMG拟合UV信号识别）来评估线性梯度实验。这些值与根据公式（11）计算的标准化梯度斜率配对。使用MATLAB?通过四阶Runge-Kutta方法在设定的盐浓度或pH条件下同时求解公式（10）和（8），拟合未知模型参数（如标准吉布斯自由能ΔG⁰_assoc,P、ΔG⁰_assoc,C以及参与结合的氨基酸数量N_a、N_b）。该估计结合了全局和局部最小化技术，以有效探索解空间，最小化平方误差和，确保鲁棒拟合。

模拟软件

高负载实验数据用于估计每个mAb电荷变体在不同pH值下的屏蔽因子。这些因子通过in silico反向拟合使用扩展的SMA模型获得。对于每个电荷变体和pH条件，确定一个屏蔽因子。使用Berkeley Madonna?版本8.3.18进行反向曲线拟合以估计屏蔽因子和进一步的in silico色谱图模拟，以优化电荷变体分离。曲线拟合过程利用软件内置的曲线拟合功能，该功能基于Nelder-Mead simplex算法操作。用于建模和模拟的进一步参数列于表1。

结果与讨论

Natrix? CH在抗体纯化中的应用

初步结合-洗脱实验显示，Natrix? CH膜在 elevated盐浓度下使用pH梯度有效分离了mAb电荷变体。与另一种商业纯离子交换吸附膜相比，Natrix? CH显示出更强的整体保留性，洗脱发生在更高pH值（5.2至6.3），而CEX膜在pH 5至5.5之间洗脱。这种延迟的保留行为和增加的耐盐性可能归因于其额外的疏水相互作用组分。此外，Natrix? CH膜表现出 distinct洗脱行为，特别是碱性变体的保留明显更晚，表明疏水配体不仅轻微影响整体保留，还显著影响选择性。增加的耐盐性使Natrix? CH特别适用于处理复杂进料或高电导率溶液。

尽管实现了分离，但分辨率需要进一步提高，因此进行了额外实验以优化过程。因此，mAb的电荷变体被纯化并富集成 distinct池，用于机理建模研究。

低蛋白质负载条件下的机理建模

进行了96次运行的线性梯度洗脱实验， resulting in a dataset evaluated and condensed to normalized gradient slope and elution conditions. 机理建模用于评估和解释预纯化电荷变体级分的线性梯度洗脱实验数据。该方法允许系统理解 governing离子交换过程的物理化学相互作用，提供了在不同pH和盐浓度条件下系统行为的宝贵见解。

最初使用了标准化学计量置换模型，该模型通常适用于简单离子交换相互作用。尽管Natrix? CH膜吸附剂具有混合模式特性，但该模型的校准成功进行，产生了与实验数据的有希望拟合。因此，继续使用离子交换模型而不是转向 specialized混合模式模型。

最终曲线拟合过程的结果显示，实验数据与理论预测之间高度一致。对于相同条件，酸性变体最先洗脱， followed by中性变体和碱性变体。该拟合涵盖了所有检查的变体 across both pH和盐梯度洗脱实验，表明膜疏水组分的贡献可忽略或一致。任何由于疏水相互作用引起的额外保留行为可能被拟合并补偿到其他模型参数中。相应的估计模型参数总结在表2中。估计值在与mAb的先前发现相当的范围内。

图3展示了蛋白质变体的结合电荷-pH profiles，说明了它们的特征电荷（ν）如何随pH变化。在pH 4.5时，所有三种变体表现出相似的电荷状态，值约为18。但随着pH增加，它们的电荷以与滴定类似的方式减少，到pH 8时值在5.5至8.6之间。每种变体遵循逐渐下降的趋势，总电荷减少最小的是碱性变体， intermediate是中性变体，最大的是酸性变体。 notably，下降速率本身在较高pH值下略微增加。这种行为与基于它们的电荷特性的预期一致：碱性变体在整个pH范围内保持较高的整体电荷，预计最后洗脱， followed by中性变体和 finally酸性变体，其在任何给定pH下具有最低电荷。

为了验证估计的模型参数，进行了in silico模拟以优化电荷变体的分离。这些模拟确定了从pH 5到pH 8和0.1到0.08 mol·L?1钠离子的反平行双pH和盐梯度作为最有效的策略。如图4所示，模拟预测了酸性和中性变体的良好分离，以及碱性变体的几乎基线分离。这种优化策略随后通过实验验证， illustrated in Fig. 4，其中模拟（实线）和实验（虚线）数据之间强烈对齐，表明成功预测和优化。值得注意的是，在中性和碱性变体之间出现了一个额外变体，由于其在初始建模数据集中的缺失，未被模拟预测。

高负载研究

动态结合容量

在pH 5和0.03 mol·L?1氯化钠条件下进行DBC实验，以评估1.06 mL膜设备和8.8 mL cassette的结合性能。两种设备在1 MV·min?1流速下评估了DBC_10%和DBC_95%。1.06 mL膜 demonstrated DBC_10% of 124 mg·mL_MV?1 and DBC_95% of 350 mg·mL_MV?1，而8.8 mL cassette achieved DBC_10% of 124 mg·mL_MV?1 and DBC_95% of 317 mg·mL_MV?1。虽然DBC_10%值相同，但DBC_95%值存在差异，1.06 mL膜表现出比8.8 mL膜高10%的结合容量。由于两种模块使用相同的膜材料，配体密度的影响可以排除。这种差异可能是由于 housing设计和 resulting不同分散效应影响的不同流动分布。值得注意的是，标准实践强调比较DBC_10%值，其中两种膜在相似停留时间2.1分钟下 demonstrate equivalent结合容量。这些结果表明，Natrix?膜实现了比其他混合模式膜吸附剂超过两倍的DBC增加。

此外，在10 MV·min?1流速（ corresponding to停留时间0.3分钟）下评估了1.06 mL膜的DBC。 under these conditions, DBC_10% was found to be 116 mg·mL_MV?1 and DBC_95% was 292 mg·mL_MV?1。这些结果表明，流速增加十倍仅导致DBC_10%减少7%和DBC_95%减少17%。相比之下，树脂基材料在类似条件下表现出高达50%的DBC减少。膜吸附剂性能在高流动条件下的这种稳定性直接转化为增强的工艺生产率，生产率从285 g·L?1·h?1（1 MV·min?1）按比例增加到2854 g·L?1·h?1（10 MV·min?1）。

屏蔽因子确定

在评估膜的结合容量并建立其操作限制后，注意力转向解决机理模型的一个关键限制：其校准仅基于低蛋白质负载数据。为了提高模型在高蛋白质浓度下的预测能力，进行了 incorporating progressively higher mAb负载浓度的实验。这些测试旨在 refine模型 under高负载条件，涉及在不同pH水平下将样品结合到膜上， followed by使用盐梯度洗脱。

虽然初始校准使用化学计量置换模型进行，但该方法未考虑空间位阻或在高负载下观察到的容量限制。为了解决这些因素，引入了SMA模型用于进一步建模。SMA模型包含了 steric hindrance coefficient，即屏蔽因子，允许更详细地表示高负载条件下的蛋白质吸附行为。

图5中呈现的洗脱曲线提供了在高负载条件下离子交换色谱中mAb电荷变体洗脱行为的见解。当在相同pH但增加样品负载下洗脱时，不同变体在大致相同的盐浓度下洗脱。然而， closer examination reveals a subtle shift in peak positions，即对于增加负载，峰略微向前移动， indicating earlier洗脱。此外，拖尾在所有变体中 evident。这两种行为表明非线性结合效应， likely due to可用结合位点的饱和，这是Langmuir结合和洗脱行为的 characteristic。

利用高负载数据，采用in silico反向拟合计算所有变体和盐梯度的屏蔽因子，成功确定了每个在不同pH值下的独特屏蔽因子（表3）。 fits的质量通过平方误差和评估。这些模拟在描述洗脱曲线方面的 precision notable，如图5所示，展示了每个变体的 fits。尽管这些模拟的高度准确性， minor discrepancies remain， potentially due to样品的复杂性， specifically三个主要变体内存在多个子变体。

表3中呈现的屏蔽因子 derived from数据 across different蛋白质负载水平， up to最大35 mg·mL?1， as主要焦点是盐梯度和放大可行性。 notably，屏蔽因子 appeared to remain independent of总负载 within this tested范围。

结果还揭示了跨pH水平的屏蔽因子的 distinct趋势。在pH 4.5时，屏蔽因子范围从酸性变体的85到碱性变体的41，中性变体为65。在pH 5.0和5.5时，屏蔽因子逐渐增加用于酸性变体（108和118 respectively），保持相似 with smaller increase用于中性变体 with 66 and 69 and碱性变体 with 44。这种趋势 continues at pH 6.0，其中中性 and碱性变体的值 only marginally increase（71 and 43），而酸性变体的值 slightly increases to 123。这种模式表明屏蔽随着所有变体的pH增加而增加， with效果最 pronounced在酸性变体中。

除了pH依赖性趋势外，屏蔽因子在每个pH值下 consistently decrease从酸性到碱性变体。这可能是由于连续更高的中性 and碱性变体的净电荷，导致与膜配体的更多相互作用 and consequently less屏蔽。

在较高pH值下屏蔽的这种增加可能归因于蛋白质电荷的减少，导致与膜配体的较弱静电相互作用 and therefore increased屏蔽。相反，在较低pH值下，由于较高蛋白质电荷导致的更强相互作用导致 reduced屏蔽。

这种pH依赖性在先前的研究中已被观察到，其中类似趋势的屏蔽行为和屏蔽因子的可比值已被报道用于离子交换色谱系统。先前的工作表明，这种依赖性可以通过经验关系有效描述，捕捉蛋白质电荷状态和配体可及性之间的相互作用。那些发现支持观察到的趋势，即增加的屏蔽发生在较高pH， likely due to蛋白质和带电配体之间减少的静电吸引。这些结果与我们的数据很好对齐，强调了屏蔽与跨不同pH条件的蛋白质电荷调制紧密相连的概念。

模型参数以及 newly确定的屏蔽因子数据被纳入 tailored用于高负载色谱场景的in silico模拟。为了评估 newly校准模型的有效性，设计了一个简单的盐梯度实验并在in silico模拟在pH 5.5和增加负载23 mg·mL_MV?1下。随后的实验验证使用包含电荷变体混合物的原始样品进行。通过离子交换HPLC鉴定了单个变体的分布。在 selected条件下用于盐梯度（图6），未实现变体的清晰分离，与使用双梯度显示的分离相反在图4中。

该实验的in silico模拟使用相同条件进行。模拟曲线显示出与实验数据的强烈一致性， only minor deviations。为了 achieve最佳一致性，碱性变体的屏蔽因子必须从 approximately 40 slightly adjusted to 30。 notably，碱性变体洗脱 around pH 7.5，一个区域其中先前未拟合屏蔽因子， introducing some uncertainty of what value to use。总体而言，获得的屏蔽因子落在与抗体文献报道范围相似的范围内，支持其 general合理性。许多对屏蔽因子的影响已在文献中显示，其中包括pH依赖性、结合取向和由于聚集导致的孔阻塞。然而，碱性变体所需的较低屏蔽因子也可能反映了模型的限制，该模型仅考虑离子交换相互作用。鉴于膜的混合模式性质，疏水相互作用可能有助于保留， particularly用于碱性变体， and thus影响表观屏蔽行为。这可以解释观察到的屏蔽因子的pH依赖性。提到的偏差也可能源于蛋白质混合物的固有复杂性，其中每个主要变体包含多个具有 slightly不同电荷状态的子变体。在pH梯度中，这些子电荷变体可能响应不同， especially在缺乏拟合参数的 regions中。

尽管如此，模拟和实验之间的强烈相关性强调了模型在预测高负载条件下色谱行为的鲁棒性。在升高负载水平下准确再现峰位置和整体洗脱模式的能力支持了模型在工艺开发和放大中的实用性。此外，观察到的Natrix? CH膜性能突出了其在复杂生物加工环境中可放大和高效蛋白质分离的潜力。

使用机理建模放大电荷变体分离

验证放大条件

为了评估可放大性并验证校准模型的鲁棒性，使用包含相同Natrix? CH材料的8.8 mL中试规模膜设备进行了放大实验。中试规模膜上的第一个实验旨在确认设备和材料使用相同的优化分离与反平行双pH和盐梯度从pH 5到pH 8和0.1到0.08 mol·L?1钠离子一致执行。洗脱曲线，如图7所示， demonstrated高相似性和几乎相同的洗脱体积当调整 for梯度体积时， any minor discrepancies potentially arising from slight variations in pH和钠离子浓度条件或设备几何形状差异。

此外，如图8(A)所示，分离质量即使在显著更高流速（超过制造商推荐的两倍以上）下也 maintained，仅最小化影响分辨率同时 substantially减少 process时间与传统树脂基材料相比。这种效率增益通过比较不同流速下的分离时间突出显示（图8(B)），展示了从时间尺度视角Natrix? CH材料的时间节约优势。这些观察也见于实验室规模膜设备（数据未显示）。

应用校准机理模型放大

在成功确认实验室和中试规模Natrix? CH膜设备之间的一致性后，下一步是通过将其应用于中试规模膜的in silico预测来测试模型的有效性，该模型最初为实验室规模设备校准。

为了实现这一点，预测了一个盐梯度实验， designed to显示高负载条件下的分离。具体地，模拟了从0.015到0.3 mol·L?1的氯化钠梯度在恒定pH 6下。样品负载设置为30 mg·mL_MV?1，流速10 mL·min?1。用于模拟高负载条件的屏蔽因子基于先前估计 given在表3中。模拟预测了碱性变体的轻微分离，随后通过实验验证。模拟和实际结果的比较显示在图9中。结果表明预测和观察数据之间良好对齐。如预测，电荷变体在0.075至0.18 mol·L?1氯化钠浓度范围内洗脱，酸性变体最先洗脱， followed by中性和碱性变体。

为了进一步评估模型的预测准确性并验证其在高负载条件下的可放大性，使用升高样品负载50 mg·mL_MV?1进行了额外实验，使用从0.1到0.08 mol·L?1钠离子的双梯度在pH 4.5到pH 9下。图10展示了 resulting洗脱曲线，其中实验数据由虚线表示，模拟数据由实线表示。总UV信号描绘为黑色，而酸性、中性和碱性变体的数据分别显示为蓝色、绿色和红色。

洗脱发生在大致梯度中间。虽然碱性变体分离优异，但酸性和中性变体仅部分解析，意味着它们可区分但未完全分离。值得注意的是，与使用优化双梯度获得的先前结果相比，酸性和中性变体 appear to洗脱在 slightly earlier条件下。这种转变可能表明由碱性变体引起的 displacement效应或可能归因于轻微的选择性变化，如先前讨论。

该实验的in silico模拟使用相同条件进行。模拟曲线显示出与实验数据的强烈一致性， only minor deviations。为了 achieve最佳一致性，碱性变体的屏蔽因子必须从 approximately 40 slightly adjusted to 30。 notably，碱性变体洗脱 around pH 7.5，一个区域其中先前未拟合屏蔽因子， introducing some uncertainty of what value to use。总体而言，获得的屏蔽因子落在与抗体文献报道范围相似的范围内，支持其 general合理性。许多对屏蔽因子的影响已在文献中显示，其中包括pH依赖性、结合取向和由于聚集导致的孔阻塞。然而，碱性变体所需的较低屏蔽因子也可能反映了模型的限制，该模型仅考虑离子交换相互作用。鉴于膜的混合模式性质，疏水相互作用可能有助于保留， particularly用于碱性变体， and thus影响表观屏蔽行为。这可以解释观察到的屏蔽因子的pH依赖性。提到的偏差也可能源于蛋白质混合物的固有复杂性，其中每个主要变体包含多个具有 slightly不同电荷状态的子变体。在pH梯度中，这些子电荷变体可能响应不同， especially在缺乏拟合参数的 regions中。

尽管如此，模拟和实验之间的强烈相关性强调了模型在预测高负载条件下色谱行为的鲁棒性。在升高负载水平下准确再现峰位置和整体洗脱模式的能力支持了模型在工艺开发和放大中的实用性。此外，观察到的Natrix? CH膜性能突出了其在复杂生物加工环境中可放大和高效蛋白质分离的潜力。

结论

本研究证明了Natrix? CH膜在实现与树脂基材料相当并在某些方面超越的电荷变体分离质量方面的功效。与传统树脂色谱不同，使用Natrix?膜的高流速显著加速了 process时间而不牺牲分辨率。通过广泛的高负载实验，确认了优异电荷变体分离的能力。In silico建模和模拟的应用使得能够校准一个高度有效的模型用于低和高蛋白质负载， employing一个简单的离子交换框架。这些模拟证明了在成功放大和优化中试规模电荷变体分离方面的工具性，展示了Natrix?膜的多功能性和效率。