STN1通过竞争性抑制TRIM32介导的泛素化保护CTC1稳定性以延缓细胞衰老

本研究发现STN1作为CST（CTC1-STN1-TEN1）复合体的关键组分，通过直接结合CTC1的OB-G结构域，竞争性抑制E3泛素连接酶TRIM32对CTC1的K48连锁泛素化修饰，从而阻止蛋白酶体降解途径。研究结合AlphaFold3结构预测、体内外泛素化实验及细胞衰老模型，揭示了TRIM32-CTC1-STN1轴在维持基因组稳定性中的新机制，为理解体细胞衰老提供了新的分子视角。

　　

STN1通过屏蔽TRIM32介导的泛素化保护CTC1稳定性以延缓细胞衰老

1 引言

基因组不稳定性和端粒缩短是细胞衰老的核心标志。端粒作为真核染色体末端的核蛋白复合体，其G链突出端（G-overhang）不仅为端粒酶提供结合位点，还能形成T环结构保护染色体末端。CST复合体（CTC1-STN1-TEN1）作为一种偏好性结合G富集序列的单链DNA结合复合物，在端粒维持和基因组稳定性中发挥关键作用。该复合体以1:1:1的化学计量比存在，其完整性对功能至关重要。研究表明，CTC1或STN1的缺失会引发细胞早衰，而其突变与严重遗传性疾病如先天性角化不良和Coats Plus综合征相关。虽然酵母研究中提示翻译后修饰（PTMs）对CST调控的重要性，但人类CST复合体的稳定性调控机制尚未明确。

2 方法

本研究采用HEK293T、HCT116和BJ成纤维细胞系，通过慢病毒/逆转录病毒系统构建稳定表达株。利用RNA干扰（siRNA）技术敲低基因表达，免疫共沉淀（Co-IP）和Western blotting分析蛋白相互作用。通过原核（E. coli BL21）和真核（Sf9昆虫细胞）系统纯化重组蛋白，进行体外pull-down实验。体内外泛素化实验采用His-Ub/K48-Ub联合MG132处理，通过Ni-NTA树脂富集泛素化产物。采用双分子荧光互补（BiFC）技术验证蛋白互作，Cycloheximide（CHX）追踪实验分析蛋白半衰期。通过SA-β-Gal染色和实时细胞分析（RTCA）评估细胞衰老表型。基于GTEx数据库的转录组数据分析基因表达与年龄的相关性，并利用AlphaFold3进行蛋白互作结构预测。

3 结果

3.1 STN1通过抑制泛素-蛋白酶体降解途径维持CTC1蛋白水平

在HCT116结肠癌细胞和BJ成纤维细胞中敲低STN1后，CTC1蛋白水平显著下降，而mRNA水平未受影响。在稳定表达Flag-CTC1的HEK293T细胞中，STN1过表达剂量依赖性地上调CTC1蛋白水平。CHX追踪实验显示CTC1半衰期约3.5小时，蛋白酶体抑制剂MG132可有效阻断其降解。内源性Co-IP证实CTC1存在泛素化修饰，体内泛素化实验进一步表明STN1能显著抑制K48连锁的多聚泛素化，证明STN1通过抑制蛋白酶体降解途径稳定CTC1。

3.2 STN1-CTC1物理相互作用是稳定性的结构基础

通过构建STN1的OB结构域（STN1_OB）和翼状螺旋-转角-螺旋结构域（STN1_wHTH）截短体，发现STN1_OB能将CTC1半衰期从3.5小时延长至8小时（STN1_WT延长至10小时），而STN1_wHTH仅轻微延长至5小时。采用OB-G结构域缺失突变体（CTC1_1196Δ7）发现，STN1无法抑制该突变体的泛素化或提升其蛋白水平，证实STN1依赖物理相互作用发挥保护功能。

3.3 TRIM32被鉴定为CTC1的E3泛素连接酶

Flag-CTC1免疫沉淀质谱分析筛选出多个E3连接酶，其中TRIM32能显著增强CTC1泛素化。体内Co-IP和体外pull-down实验验证了TRIM32-CTC1的直接结合，BiFC实验在细胞内观察到TRIM32-CTC1互作信号。TRIM32过表达促进K48连锁泛素化并加速CTC1降解（半衰期缩短至1.5小时），而缺失RING结构域的突变体（ΔRING）失去该功能，确认TRIM32作为E3连接酶催化CTC1泛素化。

3.4 Lys776是CTC1泛素化的关键位点

质谱分析发现K776是TRIM32调控的主要泛素化位点，该位点在脊椎动物中高度保守。K776R突变显著降低CTC1的K48泛素化水平，延长其半衰期，并对TRIM32介导的降解产生抵抗。但该突变体仍存在缓慢降解，提示可能存在其他泛素化位点或替代降解途径。

3.5 STN1通过竞争性结合抑制TRIM32对CTC1的泛素化

AlphaFold3结构预测显示TRIM32的NHL结构域与CTC1的OB-G结构域"裂隙"（cleft） motif结合，该区域恰好是STN1-OB的结合界面。体内实验表明STN1能抑制TRIM32增强的CTC1泛素化，但对CTC1_1196Δ7无效。GST pull-down实验证明STN1表达减少TRIM32与CTC1_WT的结合，而不影响其与CTC1_1196Δ7的互作，证实STN1通过空间竞争机制阻碍TRIM32的催化作用。

3.6 TRIM32促进体细胞早衰

GTEx数据库分析显示，60岁以上人群BJ成纤维细胞中CTC1/STN1表达随年龄增长而上调，而TRIM32表达下降。TRIM32过表达导致CTC1蛋白水平骤降，细胞增殖标志物Ki67和Lamin B1减少，DNA损伤信号增强。RTCA显示TRIM32显著抑制细胞增殖（尤其PD33和PD36代次），SA-β-Gal染色显示衰老细胞增加3倍。回补实验证实CTC1_K776R突变体能更有效逆转TRIM32诱导的衰老表型，证明TRIM32主要通过降解CTC1促进衰老。

4 讨论

本研究首次发现TRIM32作为CST复合体的E3泛素连接酶，通过介导CTC1的蛋白酶体降解促进细胞衰老。STN1通过竞争性结合CTC1的OB-G结构域，阻断TRIM32的催化作用，维持CST复合体稳定性。研究揭示了TRIM32-CTC1-STN1调控轴在衰老过程中的重要作用，为理解年龄相关性基因组不稳定提供了新机制。值得注意的是，TRIM32在癌症细胞中可通过降解p53抑制衰老，而在体细胞中呈现促衰老效应，这种细胞类型特异性的功能差异值得进一步探究。

从机制层面看，CST复合体在端粒维护（端粒酶终止、C链合成）、复制叉重启（G四链体解析、新生链保护）和DNA损伤修复（缺口填充）中发挥核心作用。衰老细胞端粒缩短和DNA损伤累积可能增加对CST功能的依赖性，这解释了老年个体中CTC1/STN1表达上调的现象。本研究发现的调控机制为相关遗传性疾病（如Coats Plus综合征）提供了潜在治疗靶点。