丙酸白藜芦醇酯通过调控线粒体凋亡通路保护SH-SY5Y细胞免受过氧化氢诱导的细胞凋亡

本研究发现丙酸白藜芦醇酯（RPE）能有效保护人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。研究通过流式细胞术证实RPE预处理可维持线粒体膜电位（MMP），调控Bcl-2/Bax蛋白表达，抑制细胞色素c释放，降低caspase-9/caspase-3活化，减少DNA碎片化和细胞凋亡。该结果表明RPE通过线粒体途径发挥神经保护作用，为神经退行性疾病防治提供了新策略。

　　

引言

随着人口老龄化加剧，阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等神经退行性疾病的发病率显著上升。大量证据表明，氧化损伤会对神经系统和大脑造成损害，在正常衰老过程和神经退行性疾病发展中扮演重要角色。因此，通过膳食补充抗氧化剂或使用药物制剂来增强或强化先天抗氧化保护机制，成为一种潜在的治疗策略。白藜芦醇（3,4′,5-三羟基芪，RSV）是一种具有多种药理活性的化合物，包括抗氧化、抗炎、化学预防、神经保护、抗肥胖和抗衰老等特性。然而，RSV存在药代动力学和药效学特性较差、生物利用度低的问题，严重限制了其应用。为解决这一问题，研究人员通过Steglich酯化反应合成了短链脂肪酸白藜芦醇酯，包括丙酸白藜芦醇酯（RPE）。先前的研究表明，RPE在抑制β-胡萝卜素漂白和Cu²⁺诱导的低密度脂蛋白（LDL）氧化方面表现最为突出。

材料与方法

本研究使用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系（ATCC CRL-2266），在DMEM/F-12混合培养基中培养，培养基补充了10%胎牛血清（FBS）、100单位青霉素和100 μg/mL链霉素。细胞在37°C、5% CO₂的湿润环境中培养。细胞活力通过MTT法测定，细胞以1×10⁵/mL的密度接种于96孔板，处理24小时后加入MTT试剂，反应2小时后用DMSO溶解甲臜，在570 nm波长下测量吸光度。

流式细胞术分析包括线粒体膜电位（MMP）测定、Bcl-2和Bax蛋白表达分析、细胞色素c释放分析、caspase-9和caspase-3活化分析、DNA碎片化测定以及annexin V-FITC/PI双染色分析。细胞以4×10⁴ cells/mL的密度接种于6 cm培养皿，用2.5或5 μM RPE预处理24小时，然后暴露于2 mM H₂O₂作用2小时。处理后收集细胞，用冷PBS洗涤两次，然后进行相应染色和分析。

MMP测定使用四甲基罗丹明乙酯（TMRE）染色，Bcl-2和Bax表达分析使用FITC标记的抗体，细胞色素c释放分析使用FITC标记的抗细胞色素c抗体，caspase活化和DNA碎片化分别使用相应的检测试剂盒，annexin V-FITC/PI双染色则用于区分凋亡和坏死细胞。

数据统计采用SPSS软件进行单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较检验，显著性水平设定为p < 0.05。

结果与讨论

神经保护活性

神经元凋亡在急慢性神经退行性疾病中起关键作用，本研究通过多种实验证实RPE对H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有保护作用。

RPE维持细胞活力

MTT实验显示，在0-7.5 μM浓度范围内，RPE对SH-SY5Y细胞无毒性作用，但在15 μM时引起20%的细胞死亡。而2 mM H₂O₂处理2小时或24小时后，细胞存活率均降至20%以下。因此，后续实验选择2.5 μM和5 μM RPE进行预处理，再使用2 mM H₂O₂处理2小时。LDH释放实验进一步验证了MTT实验的结果，表明RPE能有效保护细胞膜完整性。

RPE保护线粒体膜电位

线粒体膜电位（MMP）的丧失是细胞凋亡的早期事件。本研究使用TMRE染色通过流式细胞术评估MMP变化。结果显示，2 mM H₂O₂处理显著增加了低TMRE荧光细胞的比例，表明MMP下降。而用2.5或5 μM RPE预处理后，高TMRE荧光细胞比例显著增加，说明RPE能有效维持MMP，保护线粒体功能。

RPE调控Bcl-2和Bax表达

Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白。实验发现，H₂O₂处理显著降低Bcl-2表达并增加Bax表达。而RPE预处理能逆转这种变化，使Bcl-2表达上升，Bax表达下降。此外，单独使用RPE处理细胞（无H₂O₂）也轻微上调Bcl-2并下调Bax，虽然变化不显著，但表明RPE对细胞凋亡稳态有内在调节作用。

RPE抑制细胞色素c释放

细胞色素c从线粒体释放到胞质是凋亡过程中的关键步骤。流式细胞术分析显示，H₂O₂处理使高荧光细胞比例从74.01%降至35.20%，表明细胞色素c大量释放。而RPE预处理使高荧光细胞比例回升至50.00%和51.73%，显著抑制了细胞色素c的释放。

RPE抑制caspase活化

caspase-9和caspase-3是细胞凋亡的执行者。实验表明，H₂O₂处理显著增加了活性caspase-9和caspase-3的水平，而RPE预处理则显著降低了这两种caspase的活化水平，说明RPE通过抑制caspase通路来阻止细胞凋亡。

RPE防止DNA碎片化

DNA碎片化是细胞凋亡的晚期标志。TUNEL assay显示，H₂O₂处理显著增加了高荧光细胞比例，表明DNA碎片化加剧。而RPE预处理显著降低了高荧光细胞比例，有效抑制了DNA碎片化。

RPE减少凋亡和坏死

annexin V-FITC/PI双染色分析可将细胞分为活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。结果显示，H₂O₂处理增加了晚期凋亡和坏死细胞比例，减少了活细胞比例。而RPE预处理显著降低了晚期凋亡和坏死细胞比例，增加了活细胞比例，表明RPE能有效保护细胞免于凋亡和坏死。

潜在机制与临床意义

研究表明，RPE通过多种机制发挥神经保护作用，包括调节线粒体功能、抑制氧化应激、调控凋亡相关蛋白表达等。这些发现为RPE作为神经保护剂应用于氧化损伤相关神经疾病提供了实验依据。

结论

本研究证实RPE能有效保护SH-SY5Y细胞免受H₂O₂诱导的细胞凋亡，其机制涉及维持MMP、调节Bcl-2/Bax平衡、抑制细胞色素c释放、降低caspase活化和DNA碎片化。尽管SH-SY5Y细胞在未分化状态下不能直接模拟多巴胺能神经元，但本研究为RPE在氧化损伤相关神经疾病中的潜在应用提供了重要依据。未来研究可进一步使用分化后的SH-SY5Y细胞或体内模型验证RPE的神经保护作用。