野生番茄根际微生物组介导的对入侵昆虫长喙瘿蚊（Prodiplosis longifila）的抗性机制研究

本研究发现野生番茄（Solanum pimpinellifolium）依赖根际特异微生物组（如放线菌纲Actinoplanes）增强对入侵性吸汁昆虫长喙瘿蚊（Prodiplosis longifila）的抗性。通过土壤灭菌实验、16S rRNA扩增子测序和宏基因组分析，揭示了微生物组多样性、运动性（motility）、化学趋化性（chemotaxis）及次级代谢产物（如lanthipeptide和chorismate）合成通路在抗虫中的关键作用，为利用原生微生物组提升作物抗逆性提供了新视角。

　　

ABSTRACT

植物根系被多样的微生物群落定殖，这些微生物可影响植物生长并增强植物对（a）生物胁迫的抗性。本研究探讨了本土土壤微生物组在番茄对入侵性吸汁昆虫长喙瘿蚊（Prodiplosis longifila，双翅目：瘿蚊科）抗性中的作用。通过温室生物测定，评估了采自厄瓜多尔南部安第斯山脉的本地和农业土壤中， domesticated Solanum lycopersicum cv. Moneymaker 和野生番茄 S. pimpinellifolium 的叶片组织损伤情况。在活的本地或农业土壤中， domesticated 和野生番茄的昆虫损伤无显著差异。然而，在灭菌的本地和农业土壤中，野生番茄比 domesticated 番茄受到更严重的昆虫影响。微生物组分析显示，土壤灭菌影响了野生番茄根际细菌的整体多样性和丰度，特别是 Actinoplanes 丰度在灭菌后降低，这与昆虫抗性的丧失显著相关。宏基因组分析和 Micromonosporaceae（Actinoplanes 科）的基因组组装表明，运动性、化学趋化性、膜运输、分支酸和 lanthipeptide 生物合成可能与昆虫抗性相关。这表明，与 domesticated S. lycopersicum 相比，野生 S. pimpinellifolium 依赖于根际相关微生物组中的特定成员来获得对 P. longifila 的保护。

1 Introduction

根系相关微生物通过激素生产、增强营养获取以及保护植物免受病原体和害虫侵害，促进植物生长和健康。当前关于土壤和根系相关微生物如何影响地上昆虫食草性的知识主要来自单一微生物和在温室土壤中受控条件下种植的现代作物品种。然而，关于野生作物近缘种在原生栖息地中根系微生物组如何影响植物适应性，包括对昆虫的抗性，仍 largely unknown。本研究从厄瓜多尔南部安第斯地区采集了本地和农业土壤，并在温室生物测定中测试了这些土壤对 domesticated Solanum lycopersicum 和野生番茄 S. pimpinellifolium 的叶片组织损伤，由昆虫 Prodiplosis longifila Gagné（双翅目：瘿蚊科）引起。这种吸汁性入侵昆虫是南美洲番茄和其他茄科作物的重要经济害虫，可导致哥伦比亚番茄100%的损失和厄瓜多尔60%的损失。

2 Materials and Methods

2.1 Soil Sampling and Processing

农业和本地土壤采集自厄瓜多尔 Loja 省的 Zapotillo。农业土壤来自最近收获的玉米农场，靠近 Catamayo 河；本地土壤来自 Alamor 河的右岸，来自一片自然植被斑块，主要包括 Prosopis juliflora（豆科）、Croton wagneri（大戟科）、Ipomoea purpurea（旋花科）、Cromolaena sp.（菊科）、Parthenium hysterophorus（菊科）、Hyptis sp.（唇形科）和野生番茄 S. pimpinellifolium（茄科）。土壤运输到 Loja 国立大学的温室，室温风干7天，过筛（2毫米直径网眼）去除石块和植物碎片，并在阴凉处室温储存直至进一步处理。

2.2 Experimental Design

domesticated 番茄 Solanum lycopersicum cv. Moneymaker 及其近缘野生种 S. pimpinellifolium 在本地和农业土壤中种植。为了富集土壤中的根际微生物，活土壤经过一个“微生物激活”阶段，即在实验前将野生或 domesticated 基因型在农业和本地土壤中种植30天。之后，将完整植株和根从每个盆中移除，一半土壤体积进行热灭菌（1.5大气压，121°C，1小时，两次，间隔24小时），而另一半激活土壤保持未处理。实验包括2个番茄基因型 × 2种土壤类型（农业、本地） × 2种土壤条件（活、灭菌） × 5个重复，每个接受幼虫侵染或未侵染条件，总共80个实验单元，完全随机设计。植物在温室条件下生长34天，直到第四真叶发育阶段。

2.3 Insect Infestation

使用昆虫 Prodiplosis longifila Gagné（双翅目：瘿蚊科）侵染番茄叶片。从厄瓜多尔 Catamayo 的番茄田间（S. lycopersicum cv. Elpida）采集带有 P. longifila 幼虫的侵染叶片，并小心地将10只 second-instar 幼虫转移到34天龄植株的上部叶片。每个侵染植株在侵染后7天（dpi）检查昆虫损伤。叶片损伤通过 ImageJ 量化，损伤比例通过损伤面积除以总叶面积计算。数据使用 RStudio 环境中的线性模型进行方差分析（ANOVA）。

2.4 DNA Extraction From the Tomato Rhizosphere for Microbiome Profiling

收获41天龄番茄植株后，根 vigorously shaken 去除松散附着的土壤。根系统放入15 mL 管中，加入4 mL LifeGuard Soil Preservation Solution，4°C储存。在 Loja 国立大学生物技术实验室，根际样品分成三个子样品，使用 Qiagen DNeasy PowerSoil Kit 提取基因组 DNA。DNA样品送 Genome Québec 进行扩增子文库制备和后续16S rRNA基因V3-V4区域测序，使用通用细菌引物341F和805R。在 Illumina NovaSeqX Plus 平台上生成 paired-end 序列 reads（300 bp长度）。另外，对八个 pooled 根际样品进行 shotgun 测序。

2.5 Amplicon Data Analysis

FASTQ格式文件中的压缩序列 reads 通过 DADA2 v1.16.0 pipeline 处理，获得 ASV 丰度和分类表。使用 SILVA 16S ribosomal RNA gene reference database（v138）进行细菌分类分配。在 RStudio 环境中进行统计分析，使用 vegan、phyloseq、metagenomeSeq 和 ggplot2 包进行 alpha 多样性（ANOVA, Tukey HSD post hoc test）、beta 多样性（Bray–Curtis distance, PERMANOVA with 9999 permutations）和差异丰度分析。丰度数据通过 CSS（Cumulative Sum Scaling）标准化。使用 vegan 包的 cca 函数进行 Canonical Correspondence Analysis（CCA），评估叶片损伤水平如何影响细菌属的分布。

2.6 Metagenome Data Analysis

压缩的 paired-end FASTQ 文件使用 SqueezeMeta v1.5.1 处理。使用 Megahit 进行 co-assembly。16S RNAs 通过 Barrnap 预测，并使用 RDP classifier 进行分类。ORFs 通过 Prodigal 预测。使用 Diamond 进行 GenBank、EggNOG、KEGG 的相似性搜索。使用 Bowtie2 进行 reads 映射，使用 MaxBin2 和 Metabat2 进行 binning，使用 DAS Tool 组合结果以获得精炼 bins。使用 CheckM 计算 bin 完整性和污染，选择完整性高于70%且污染低于10%的69个 bins。一个高质量的未分类 Micromonosporaceae bin 提交到 RAST server 进行功能注释，并提交到 antiSMASH software version 7 注释 BGCs（biosynthetic gene clusters）。

3 Results

3.1 Impact of Tomato Genotype and Soil Condition on Insect Leaf Damage

昆虫幼虫在所有处理中引起显著的叶片损伤。线性模型评估土壤类型、土壤条件和番茄基因型及其与叶片损伤比例的交互作用，解释了21.4%的方差（adjusted R² = 0.182, F(7, 175) = 6.786, p = 3.962e-07）。土壤条件和番茄基因型之间的交互作用对叶片损伤比例有显著影响（p = 0.000226），野生番茄在灭菌土壤中表现出比加性效应 alone 更高的损伤。ANOVA 结果确认番茄基因型（p = 1.747e-05）、土壤条件（p = 0.037）及其交互作用（p = 8.278e-06）是食草性的显著预测因子。 domesticated 和野生番茄在农业（分别为5.66%和2.99%）或本地土壤（分别为4.82%和5.69%）中表现出低水平的昆虫叶片损伤。当农业和本地土壤灭菌后， domesticated 番茄品种保持对昆虫叶片损伤的抗性，而野生番茄在灭菌农业和本地土壤中的昆虫叶片损伤显著增加，分别达到11.8%和12.5%。这些结果表明，与 domesticated 番茄相比，野生番茄依赖于土壤（微）生物组来保护 against P. longifila。

3.2 Effect of Soil Sterilisation on Tomato Rhizosphere Microbiome Composition

根际细菌群落的 alpha 多样性在活土壤中种植的番茄植株中显著高于灭菌土壤中的植株（ANOVA, p = 9.9e-13），这反映在活土壤中更高的 Shannon 指数上。 P. longifila 幼虫的侵染对总叶面积没有显著影响（ANOVA, p = 0.2623），也没有显著改变整体根际细菌群落组成（PERMANOVA, p = 0.0531）。然而，活和灭菌土壤条件之间的 beta 多样性存在显著差异（PERMANOVA, p = 0.0001）。当仅考虑侵染处理时，土壤类型和条件之间的交互作用仍然显著（p = 0.0001），表明土壤类型对微生物群落的影响受土壤灭菌的影响。灭菌似乎减少了农业和本地土壤之间的组成差异，如 PCoA 图所示，灭菌样品紧密聚集， regardless of soil type。

3.3 Changes in Wild Tomato Rhizosphere Composition by Soil Sterilisation Are Associated With Leaf Damage

为了探索根际细菌群落组成的变化是否与 P. longifila 引起的叶片损伤水平相关，对野生番茄在活或灭菌本地和农业土壤中的扩增子数据进行差异丰度分析。分析显示，260个 ASVs 在活农业和本地土壤之间共享，而101个 ASVs 在灭菌农业和本地土壤之间共享。土壤灭菌影响了 Actinobacteriota、Acidobacteriota、Chloroflexi、Cyanobacteria、Gemmatimonadota 和 Myxococcota 门特定成员的相对丰度。CCA 鉴定出 genera 如 Actinoplanes、Geodermatophilus、Microcoleus、Terrabacter、Krasilnikovia、Pseudonocardia、MND1、RB41 和 Herpetosiphon 更 strongly associated with 活土壤的细菌群落，而 Paenarthrobacter、Pseudomonas、Parasegetibacter、Pedobacter、Caulobacter 和 Chitinophaga 是灭菌土壤中观察到的变异的关键贡献者。CCA 结果表明，叶片损伤水平显著影响细菌群落（CCA model ANOVA, p = 0.007），第一约束轴（CCA1）解释了方差的10.4%。

3.4 Functional Features of Key Rhizobacterial Genera Associated With Leaf Damage

为了深入了解细菌属 Actinoplanes 的功能特征，该属与低和中度叶片损伤水平相关，我们对一组 pooled 根际土壤样品进行了 shotgun 测序。一个高质量的 metagenome-assembled genome（MAG），bin 580，具有88.42%完整性和2.59%污染，在科水平 classified as Micromonosporaceae，其中包括 genus Actinoplanes。为了研究其功能特征，使用 RAST 和 antiSMASH 对 MAG 进行注释。 Actinoplanes bin 580 包含883个 protein-encoding genes，并根据 SEED categories characterized by features related to motility and chemotaxis，以及 secondary metabolism。此外，该 MAG 表现出更多与膜运输、氮代谢、蛋白质代谢、次级代谢、硫代谢以及毒力、疾病和防御相关的基因。在 Actinoplanes bin 580 中鉴定出11个 biosynthetic gene clusters（BGCs）。其中三个注释为：一个 type III polyketide synthase（PKS）簇，预测编码 loseolamycins A1 and A2；一个 aminopolycarboxylic-acid BGC，与 siderophore ethylenediaminesuccinic acid hydroxyarginine（EDHA）相关；和一个 terpene BGC，预测编码 isorenieratene，尽管与已知参考的相似性较低。

4 Discussion

据推测，野生作物近缘种及其原生微生物组共同进化以抵御（a）生物胁迫。相比之下，农业系统内的环境干扰 combined with 植物育种中的遗传修饰可能导致 domesticated 植物与其微生物组之间有益相互作用的丧失。在我们的研究中，我们观察到在活本地或农业土壤中种植的 domesticated 和野生番茄上，由吸汁性入侵昆虫 P. longifila 引起的叶片损伤没有显著差异。然而，土壤灭菌引起的微生物组破坏导致野生番茄在本地和农业土壤中的昆虫叶片损伤显著增加，但 domesticated 番茄中没有。这些结果表明，与 domesticated S. lycopersicum 相比，野生 S. pimpinellifolium 依赖于根际相关微生物组中的特定成员来保护 against 入侵昆虫 P. longifila aboveground。这也表明 domesticated 番茄具有一种内在的对入侵昆虫的抗性，这种抗性 largely independent from 土壤微生物组。

随后的分析显示，土壤的热灭菌导致野生番茄在农业和本地土壤中的叶片损伤显著增加。土壤灭菌显著降低了在本地和农业土壤中种植的番茄根际细菌群落的 alpha-diversity。此外，观察到的根际微生物组组成差异 primarily due to 土壤类型（农业、本地）和土壤条件（活、灭菌）的交互作用，而不是番茄基因型。这与先前的研究一致，表明土壤对根际组装的影响强于植物宿主基因型。尽管根际微生物组组装在两个番茄基因型中相似，但灭菌土壤中野生番茄根际微生物组的变化表明根际微生物组在 minimize P. longifila 叶片损伤中的推定作用。

差异丰度分析进一步揭示， several bacterial phyla 的丰度受土壤灭菌影响，如 Actinobacteriota、Acidobacteriota、Chloroflexi、Cyanobacteria、Gemmatimonadota and Myxococcota。 Actinobacteriota 和 Cyanobacteria 门的成员已被研究用于生产杀虫化合物。更具体地，我们发现 Actinoplanes、Geodermatophilus、Microcoleus、Terrabacter、Krasilnikovia、Pseudonocardia、MND1、RB41 and Herpetosiphon 在野生番茄根际中更丰富，而 Paenarthrobacter、Pseudomonas、Parasegetibacter、Pedobacter、Caulobacter and Chitinophaga 在灭菌土壤中种植的番茄根际中更丰富。这些细菌属与 P. longifila 引起的叶片损伤水平显著相关。 Actinoplanes spp. 已被研究作为针对其他双翅目物种的潜在杀虫剂。

尽管如此，我们对 MAG Actinoplanes bin 580 的分析提供了一些关于可能与野生番茄对 P. longifila 抗性相关的功能特征的初步见解。其中，运动性和化学趋化性 SEED subsystem characterized by 鞭毛功能，如编码肽聚糖（FtsI）和鞭毛蛋白（FlaA, FlgB, FlgC and FliE）合成的基因。这些基因涉及激活细菌分裂和组装鞭毛的蛋白质组件。鞭毛是细菌运动性和定殖以及 adherence to 宿主表面所必需的。鞭毛和菌毛是 Actinoplanes 游动孢子的 distinctive features。特别是，在“bin 580”中发现的菌毛基因，如 PilB、PilC、PilM and PilT，可能允许 Actinoplanes 游动孢子定殖和附着在番茄根表面。互补地，在 Actinoplanes bin 580 中， widespread colonisation island subsystem 的基因包括 tight adherence（TAD）基因，如 TadA、TadB、TadC and TadZ，以及菌毛蛋白编码基因 Flp， suggest Actinoplanes' capacity to colonise host tissues and surfaces of several environmental habitats。

此外，运动性特征已被描述为与高碳可用性（如根际）中的细菌生态位分化相关。此外，次级代谢 SEED category 中编码 lanthionine synthetases（LanB, LanL）的基因的存在表明 lanthipeptides 生物合成的潜力，这些肽已证明对革兰氏阳性细菌具有抗菌活性，通过破坏细胞壁生物合成，以及免疫调节活性。此外， lanthipeptides 可以在一些放线菌中发挥调节气生菌丝形成的作用，抗菌活性有限。此外，编码氨基酸和衍生物的基因在“bin 580”中表明分支酸的生物合成，这是几种次级代谢产物的前体，如芳香族化合物，包括色氨酸，涉及电子传输、信号通信、植物防御和伤口响应。特别是，分支酸和芳香族氨基酸生物合成的特征可能调节植物对 P. longifila 的防御响应，这已在其他关于对细菌病原体和 phloem-feeding 昆虫的诱导抗性的研究中得到证明。

最后，我们还检测到一个推定用于萜烯 isorenieratene 生物合成的簇，这是某些放线菌的特征，以应对氧化应激。 antiSMASH 结果还表明 Actinoplanes harbours various underexploited natural products。这些发现进一步强调了分离 Actinoplanes spp.、测试其生物合成潜力以及确定这些代谢物在保护野生番茄 against P. longifila 中的推定作用的重要性。

总之，本研究的结果突出了探索 origin soils 的潜力，这些土壤 harbours 经济重要现代作物的近缘野生种的可行种群。这些土壤可能作为对各种害虫和疾病抗性的宝贵微生物库。这是一个有前景的研究领域，特别是在理解地下微生物群落如何与特定植物基因型结合， potentially promote 对地上昆虫害虫的抗性。因此，整合基因组学方法，包括验证关键微生物类群，以及评估植物代谢物和防御激素，对于建立和验证微生物群落与植物防御途径之间的机制联系至关重要。阐明这些动态和这些“祖先微生物群”的作用模式可能为设计创新农业实践铺平道路，这些实践利用天然土壤微生物组提高作物韧性。