基于转录组测序的芭蕉芋SSR标记开发与遗传多样性分析及其在种质资源鉴定中的应用

本刊推荐：本研究通过芭蕉芋（Musa basjoo）转录组测序，开发了10对高多态性SSR标记（PIC>0.5），成功对45份芭蕉属种质进行遗传多样性分析。研究发现三核苷酸重复（44.03%）为优势重复类型，ACC/GGT为高频 motif。UPGMA聚类将种质分为三大类群，为芭蕉芋种质资源保护、分子辅助育种及药材（Rhizoma Musae）质量控制提供重要分子工具。

　　

引言

芭蕉属（Musa spp.）作为广泛分布于热带和亚热带地区的植物，在中国南方多个省份均有种植。其中芭蕉芋（Musa basjoo Siebold et Zucc.）的干燥根茎被称为“芭蕉芋”（Rhizoma Musae），是贵州苗族地区重要的传统药用资源，被收录于《贵州省中药材及民族药材质量标准（2019年版）》。现代药理研究表明，芭蕉芋具有抗炎、镇痛、抗菌和抗氧化等多种生物活性，其活性成分涵盖糖类、氨基酸、有机酸、黄酮、甾体和挥发油等。以芭蕉芋为主要成分的骨康胶囊在治疗骨关节炎和骨折等方面显示出显著的临床疗效。

简单重复序列（Simple Sequence Repeats, SSR）又称微卫星，是由1-6个核苷酸串联重复组成的分子标记，具有高多态性和共显性遗传等特点，被广泛应用于个体和群体水平的遗传变异分析。随着测序技术的发展，基于转录组数据的EST-SSR标记在药用植物分子生物学研究中展现出巨大潜力，尤其在缺乏参考基因组的物种中（如砂仁、苍术和细辛等）成为评估遗传多样性的重要工具。

目前，芭蕉芋药材主要来源于野生采集，但由于芭蕉属植物形态相似，传统形态学方法难以准确鉴定。同时，人工栽培仍处于起步阶段，不同产地种质资源间的遗传关系尚不明确，这严重制约了资源的有效分析和利用。本研究通过芭蕉芋转录组测序，分析EST-SSR位点的组成、分布和特征，开发多态性EST-SSR标记，并对具有不同群体结构的芭蕉芋资源进行遗传分类，为芭蕉芋种质资源保护、分子辅助育种和不同产区药材品种分析奠定基础。

材料与方法

实验材料

研究收集了45份芭蕉属种质资源，采样地覆盖贵州、广西、江西、江苏和福建等主要芭蕉芋产区。采集健康新鲜叶片后，使用分子样本采集袋保存，并置于装有干燥硅胶的密封盒中。所有样本由贵州省亚热带作物研究所副研究员韩树权基于植物分类学标准进行鉴定。

转录组测序

从贵州省亚热带作物研究所旺摩科技示范园栽培的芭蕉芋样本中采集新鲜叶片，使用总RNA提取试剂盒（上海生工）提取总RNA。使用NanoDrop 2000测定RNA浓度（OD_260/280为1.8-2.0），合格样本用于cDNA文库构建。mRNA样本使用Illumina NovaSeq 6000平台进行测序，产生高质量原始数据（错误率<0.1%，Q20>85%，Q30>80%）。使用Trinity软件对clean reads进行从头组装，获得EST序列转录本，进一步优化后得到非冗余unigene集合。将得到的unigene与GO（基因本体论）、KEGG（京都基因与基因组百科全书）、EggNOG（非监督直系同源基因分组）、NR（NCBI非冗余蛋白序列数据库）、Swiss-Prot（瑞士Prot序列数据库）和Pfam（蛋白质家族数据库）进行比对注释。

引物设计与合成

使用MISA软件识别芭蕉芋EST-SSR位点（默认参数）。使用Primer3 v2.3.4进行引物设计，根据以下标准筛选出100对引物：二核苷酸重复≥10次，去除冗余序列，随机选择预测扩增产物>110 bp的引物。这些引物的长度为18-25 bp，GC含量为40%-60%，退火温度为55°C-65°C，预期扩增片段大小为100-300 bp。

SSR多态性引物筛选

使用DNAsecure植物试剂盒（天根，北京）从每个样本的冻干叶片中提取基因组DNA。选择4个表型变异显著的芭蕉属种质进行SSR引物筛选。20 μL反应体系包含：2 μL DNA模板，2× Rapid Taq Master Mix，0.6 μL上游和下游引物（10 μmol/L），7.4 μL ddH₂O。PCR扩增程序为：94°C预变性5 min；94°C变性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸50 s，10个循环；94°C变性30 s，54°C退火30 s，72°C延伸50 s，27个循环；72°C最终延伸5 min，4°C保存。PCR产物首先通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析确认无离散条带，随后进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，从中筛选出10对高多态性引物对。

芭蕉芋种质鉴定

对45份芭蕉芋样本的DNA进行PCR扩增，使用6-羧基荧光素（FAM）进行荧光标记。在ABI-3730XL遗传分析仪上进行毛细管电泳，检测荧光信号和相应的峰位置。

遗传多样性分析

使用Genemarker V2.2.0处理毛细管电泳获得的原始数据。通过比较每条泳道中分子量内标位置与每个样本的相应峰来确定片段大小。使用POPGENE32软件评估每个引物和群体的遗传多样性。使用Nei's遗传同一性（I）和遗传距离（D）量化群体间的遗传分化。基于遗传距离，使用MEGA 11构建UPGMA树，并在iTOL平台上进行二次修改。

结果

芭蕉芋转录组Unigenes功能注释

高通量转录组测序产生7.65 Gb高质量数据，Q20和Q30值分别为99.07%和96.83%，GC含量为51.21%，表明测序质量可靠，适合进一步分析。使用Trinity软件进行序列组装，获得38,806条unigenes，平均长度为993.00 bp。与六个主要数据库（GO、KEGG、eggNOG、NR、Swiss-Prot和Pfam）的比较分析显示，注释的unigene数量分别为23,558、12,412、25,448、28,101、20,056和18,460条。

Nr功能注释

芭蕉芋转录组与Nr数据库的比较显示，序列相似性最高的物种包括：Musa acuminata（13,232条，47.09%）、Musa balbisiana（6,323条，22.50%）、Ensete ventricosum（4,043条，14.39%）和Musa troglodytarum（3,259条，11.60%）。

GO功能注释

芭蕉芋转录组中的unigenes被分配到三个GO类别：生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），共获得48个注释。在12个CC条目中，最多注释的unigenes与膜、细胞部分和细胞器相关。BP的21个条目显示主要注释集中在细胞过程、代谢过程和生物调节。MF类别中的15个条目以结合、催化活性和转录调节活性最为普遍。

KEGG功能注释

芭蕉芋转录组的unigenes映射到22条KEGG通路，分为五个主要类别：代谢、遗传信息处理、细胞过程、环境信息处理和生物系统。代谢类别的unigenes数量最多，共4,288个注释。在代谢类别中，碳水化合物代谢的unigenes数量最高（926），其次是氨基酸代谢（546）、全局和概述图谱（484）和能量代谢（481）。

芭蕉芋转录组序列中SSR位点信息

使用MISA软件分析芭蕉芋转录组unigene中的SSR位点，共识别出7,501个SSR位点，分布频率为19.33%。SSR按重复类型分为六类，其中三核苷酸重复占大多数（44.03%），其次是二核苷酸（43.87%）、单核苷酸（24.73%）、四核苷酸（1.64%）、六核苷酸（0.52%）和五核苷酸（0.51%）。最常见的重复单元是AG/CT、A/T和ACC/GGT，分别占32.78%、20.20%和2.41%。这些发现为开发芭蕉芋特异性分子标记奠定了基础。

EST-SSR引物筛选与遗传多样性分析

选择4个表型变异显著的芭蕉属种质（GZ-1、JS-1、WM-1和WM-19）进行100对随机引物的扩增。初步筛选结果显示，60对引物能成功扩增出清晰条带且重复性良好，扩增成功率为60%。随后通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析这60对引物，最终筛选出10对具有显著多态性的引物，引物有效率为16.67%。最后使用这10对多态性引物对45份芭蕉属资源进行毛细管电泳扩增。

45份芭蕉属种质遗传多样性分析

使用筛选出的多态性引物对45份芭蕉属种质进行遗传多样性分析，共检测到104个等位基因（Na），平均每个引物对10.400个等位基因。有效等位基因数（Ne）范围为3.164-8.691，平均为5.195。有效等位基因变异比例（Ne/Na）为49.95%。香农指数（I）范围为1.459-2.339，平均为1.835。观测杂合度（Ho）范围为0.222-0.733，平均为0.576，而期望杂合度（He）范围为0.692-0.895，平均为0.795。多态信息含量（PIC）值范围为0.639-0.874，平均为0.759。固定指数变异（Fis）范围为0.112-0.698，平均为0.270。总体而言，10对EST-SSR引物表现出高度多态性，反映了45份芭蕉属种质间显著的遗传多样性。

基于10个EST-SSR标记的基因分型结果，使用UPGMA方法对45份芭蕉属种质进行聚类分析。UPGMA树显示三个不同的类群：类群A包括来自GZ、JS、GX和部分WM群体的36个个体；类群B包含剩余WM群体的12个个体；类群C包含来自FJ和JX群体的9个个体。

讨论

随着转录组测序技术的进步和测序成本的降低，转录组数据为缺乏参考基因组的药用植物开发分子标记提供了宝贵资源。本研究基于芭蕉芋转录组数据开发了EST-SSR标记，并利用产地信息进行了初步种源分类。这些标记能够遗传区分不同产地的群体，便于有针对性地对具有独特遗传特征的地区进行就地保护。此外，由于这些标记是苗族药物芭蕉芋鉴定的基础，保护工作可以战略性地集中在保障维持药材质量和确保这种宝贵草药材料长期可用所必需的遗传资源上。

芭蕉芋转录组测序鉴定出38,806条具有注释数据的unigenes。与eggNOG数据库的比较分析显示，293个注释与次级代谢物的生物合成、运输和分解代谢相关。通过KEGG数据库的进一步分析发现，280个unigenes与多种次级代谢物的生物合成相关，156个unigenes与萜类和聚酮类代谢相关。先前研究表明，芭蕉芋含有羽扇豆酮和β-谷甾醇，这些化合物能够刺激胰腺β细胞胰岛素分泌，增强葡萄糖摄取和利用，最终降低血糖水平。此外，7β-羟基吴茱萸次碱、7,8-二羟基香豆素和松属素二乙酸酯是芭蕉芋中的关键活性成分，它们通过MAPK信号通路、脂质与动脉粥样硬化、PI3K-Akt和IL-17等信号通路促进骨细胞增殖并发挥抗炎作用。芭蕉芋的Unigene注释信息有望为解析芭蕉芋关键活性成分的代谢途径和探索关键基因提供参考。

当物种缺乏参考基因组信息时，利用高通量转录组测序开发SSR分子标记确实是一种好方法，具有成本低、效率高的优点。本研究共检索到7,501个SSR位点，SSR位点分布频率为19.33%，高于黄连（13.72%）、鱼腥草（7.51%）和多花黄精（9.73%）等药用植物。这表明芭蕉根转录组中的SSR数量相对丰富。芭蕉芋转录组中SSR motif类型多样，其中三核苷酸重复和二核苷酸重复占主导地位，分别占44.03%和43.87%。它们的motif结构与白木香、川贝母和穿心莲相似。有研究认为，当非3倍数的SSR motif位于编码区时，会引发移码突变，这种突变压力限制了此类SSR motif的出现频率。也有研究发现三核苷酸重复在植物基因组中表现出高丰度。

PIC是一个重要的遗传参数。有研究报道PIC值大于0.5表明高度多态性。本研究中筛选的10对EST-SSR引物的PIC值均大于0.5，平均PIC值为0.759。值得注意的是，这些标记超越了先前开发的12个芭蕉属SSR引物（PIC值范围0.00-0.37，平均=0.12），因此显示出显著更强的遗传判别力。基于遗传距离的UPGMA树将45份芭蕉属种质分为三类。具体而言，来自GZ（包括SQ）、JS和GX的个体被归为一类，而来自FJ和JX的个体被聚为另一类。这可能是因为样本采集自野外，由于地理因素，它们之间的交流相对有限，从而反映了群体间的差异。WM组中的个体被分为两类，主要是因为样本来源于本研究所的种质资源圃，种质资源收集自不同的地理区域，因此导致不同的分类。WM组个体的分类结果凸显了地理起源对种质特征的显著影响。它进一步强调了芭蕉属种质资源内部的复杂性和多样性。然而，种质库样本中受控采样年份的缺乏和栽培历史差异限制了遗传类群的功能解释。未来的研究可以侧重于更深入地探索这些区域差异，以更好地了解不同芭蕉芋种质之间的遗传变异和潜在独特性状，这必将有助于更全面地利用和保护这些宝贵的资源。

结论

综上所述，本研究采用高通量测序技术对芭蕉芋转录组进行表征，共鉴定出38,806条unigenes，发现7,501个SSR位点，SSR位点分布频率为19.33%。在重复motif中，三核苷酸重复最为普遍，占44.03%，主要类型为AG/CT、A/T和ACC/GGT。经过多态性验证，从芭蕉芋转录组数据库中开发出10个高度多态且重复性好的SSR标记，能够有效区分45份芭蕉属种质资源。这些SSR标记为芭蕉芋种源分类和其根茎掺假物鉴定提供了科学依据。未来，将芭蕉芋的药用成分与分子标记联系起来，将有助于筛选高产的芭蕉芋资源。