早产儿视网膜病变中内皮细胞MEMO1调控血管生成信号的作用机制

本研究揭示了MEMO1蛋白在早产儿视网膜病变(ROP)中的新型调控作用。通过大鼠模型和细胞实验发现，MEMO1通过抑制VEGF/VEGFR2/STAT3信号通路限制病理性玻璃体新生血管(IVNV)形成，同时通过激活AKT通路促进生理性血管生成。这一发现为靶向MEMO1治疗ROP提供了新策略，可在抑制病理血管生成的同时保护正常血管发育。

　　

引言

早产儿视网膜病变(ROP)是全球儿童盲和视力丧失的主要原因之一。其病理生理学可用两阶段假说来描述：早产儿出生时视网膜血管尚未完全发育，在第一阶段，多种应激因素导致周边发育性视网膜内血管化(IRV)延迟，已形成的视网膜血管中的毛细血管受到损伤；在第二阶段，无血管视网膜区域在脱离高浓度补充氧后变得缺氧，刺激血管生成因子产生，导致玻璃体内出现无序的血管生长，即玻璃体新生血管(IVNV)。IVNV不仅无法支持早产儿的视力发育，还会引发出血、瘢痕形成和复杂性视网膜脱离导致失明。

血管内皮生长因子(VEGF)在ROP的发育性和病理性血管生成中都起着重要作用。VEGF通过内皮细胞中的VEGF受体2(VEGFR2)传递信号，既能延伸IRV，当过表达时又会导致无序的IVNV生长。调节内皮细胞中的VEGFR2信号传导可以延伸IRV并减少IVNV。虽然干扰VEGF介导的信号传导的药物(抗VEGF药物)改善了早产儿的视觉结局，但由于VEGF对神经元、胶质细胞和内皮细胞具有生存因子的作用，存在安全性顾虑。此外，即使最初使用抗VEGF药物治疗ROP取得成功，也有严重ROP复发的报道。因此，需要优化通过VEGFR2在内皮细胞中的信号传导调节，以安全地延伸IRV，从而干扰病理性IVNV， potentially 降低复发风险，并扩大面临严重ROP风险的早产儿的视野。

MEMO1在ROP氧应激反应中的表达增加

通过挖掘公开可用数据集发现，MEMO1在人类视网膜和内皮细胞中均有表达。实验证明，与常氧条件(~21% O₂)相比，暴露于低氧条件(~10% O₂)的人视网膜微血管内皮细胞(hRMVECs)中MEMO1 mRNA表达显著升高。同样，用VEGF处理的hRMVECs与PBS处理的细胞相比，MEMO1 mRNA表达也显著增加。

在蛋白质水平上，MEMO1在常氧(RA)和氧诱导视网膜病变(OIR)的p18时间点（此时VEGF表达增加）的光感受器层中均有发现，但在p5时间点（此时大鼠光感受器尚未完全发育）未观察到。此外，MEMO1与p18 OIR大鼠的视网膜前新生血管丛共定位，但不与IRV共定位。在p5或p18 RA饲养的大鼠中，也未观察到MEMO1与IRV的共定位。这些发现支持了内皮MEMO1参与IVNV发展而非IRV的假设，且这一过程由低氧或VEGF介导。

MEMO1参与培养的人微血管内皮细胞中VEGF触发的信号传导

通过敲低或过表达MEMO1在hRMVECs中，测量了对VEGF诱导的IVNV中涉及的信号效应物的影响。与对照siRNA相比，MEMO1 siRNA转染48小时后，MEMO1 mRNA表达显著降低约90%，MEMO1蛋白表达也可见减少。使用Ad-GFP或Ad-MEMO1转导48小时后，与Ad-GFP转导的hRMVECs相比，Ad-MEMO1转导的细胞中MEMO1 mRNA和MEMO1蛋白表达均显著增加。

用VEGF处理转染对照或MEMO1 siRNA的hRMVECs长达2小时。与假设相反，MEMO1敲低与VEGF处理2小时后VEGFR2磷酸化增加相关，以及VEGF处理1小时后STAT3磷酸化增加。在平行实验中，用Ad-GFP或Ad-MEMO1转导hRMVECs。用对照Ad-GFP转导并经VEGF处理的hRMVECs在30分钟后VEGFR2磷酸化如预期那样升高，但与基线相比，用Ad-MEMO1转导并经VEGF处理的hRMVECs中VEGFR2磷酸化未增加。此外，与用Ad-GFP转导的细胞相比，用Ad-MEMO1转导的hRMVECs在VEGF处理30分钟或2小时后，VEGFR2和STAT3磷酸化显著降低。这些数据表明，MEMO1不是维持VEGF诱导的通过VEGFR2的信号传导，而是调节VEGF介导的VEGFR2和STAT3磷酸化。

MEMO1参与VEGF诱导的培养的人视网膜微血管内皮细胞伤口闭合

使用伤口闭合试验评估了MEMO1的体外功能作用。无论是对照siRNA转染还是对照腺病毒转导，VEGF均显著增加与PBS相比的伤口闭合。在VEGF处理下，MEMO1敲低组的伤口闭合显著高于对照敲低组。相反，在VEGF处理后，MEMO1过表达组的伤口闭合与对照腺病毒组无显著差异。在没有VEGF的情况下（即PBS处理），MEMO1敲低并未增加伤口闭合；然而，MEMO1过表达显著增加了伤口闭合。数据表明，MEMO1抑制了VEGF诱导的伤口闭合，并参与了不依赖VEGF处理的伤口闭合。

MEMO1通过AKT和ERK激活调节人视网膜微血管内皮细胞中的伤口闭合

探索了可能参与MEMO1介导的伤口闭合的其他效应物。文献支持MEMO1过表达在不依赖应激源的情况下激活AKT和ERK。AKT和ERK的激活与内皮细胞中VEGF介导的信号传导有关。此外，VEGF介导的AKT磷酸化参与内皮细胞的存活和迁移，而VEGF介导的ERK磷酸化参与内皮细胞的增殖和迁移，以及在大鼠ROP模型中的IVNV。

实验观察到，尽管MEMO1过表达在VEGF处理30分钟或2小时后增加了ERK磷酸化，但与对照相比，MEMO1过表达对AKT磷酸化的影响在基线（PBS处理）和所有VEGF处理时间点均显著更大。AKT激活与细胞增殖和存活有关。因此，假设在MEMO1过表达存在下抑制hRMVECs的增殖会减少伤口闭合。支持这一预测的是，用丝裂霉素预处理可防止Ad-MEMO1转导细胞与Ad-GFP对照相比在响应PBS时的显著伤口闭合。VEGF处理后，观察到Ad-MEMO1与Ad-GFP转导细胞相比伤口闭合显著增加；然而，与没有丝裂霉素预处理的平行实验相比，伤口闭合的倍增减少。这些发现表明，MEMO1不仅调节参与迁移的内皮细胞增殖，而且在细胞增殖减少和MEMO1过表达时也调节VEGF诱导的迁移。

MEMO1在大鼠ROP模型中对IVNV发展的必要性

使用高度代表人类ROP的大鼠ROP模型测试了MEMO1的体内效应。开发了含有针对MEMO1或荧光素酶作为对照的shRNA的GFP标记慢病毒载体，并通过视网膜下注射递送这些载体。基于细胞培养结果， refined 假设预测MEMO1敲低会增加与对照相比的IVNV。

为了评估视网膜内皮细胞特异性MEMO1敲低在OIR中的效应，设计了三种不同的针对大鼠Memo1和以Luciferase为对照的shRNA序列，并将其插入Cdh5质粒中并制成慢病毒载体。确定了在转导的rRMVECs中与L-Luc.shRNA相比提供最大MEMO1蛋白敲低的L-Memo1.shRNA，并用于后续实验。为了验证IVNV中的MEMO1敲低，测量了来自用视网膜下L-Luc.shRNA或L-MEMO1.shRNA处理并在OIR中饲养的大鼠幼崽的视网膜平铺片中凝集素标记的IVNV和MEMO1的共标记。观察到用L-MEMO1.shRNA处理的大鼠幼崽的视网膜平铺片中与凝集素标记的IVNV共定位的MEMO1显著减少。

与用L-Luc.shRNA处理的大鼠幼崽相比，用L-Memo1.shRNA处理的大鼠幼崽IVNV显著增加，但通过周边无血管视网膜(AVA)测量的IRV无显著差异。数据支持 refined 预测，即视网膜内皮细胞中的MEMO1防止IVNV，并且不干扰大鼠ROP模型中的IRV。

讨论

MEMO1是一种适配器蛋白，促进受体酪氨酸激酶的下游信号传导，包括ERBB家族受体酪氨酸激酶、成纤维细胞生长因子(FGF)和胰岛素样生长因子(IGF/IGFR)。早期文献报道MEMO1与癌细胞的侵袭性迁移有关。在大鼠ROP模型的IVNV中而非IRV中鉴定出MEMO1，并显示MEMO1在暴露于VEGF或低氧的培养的hRMVECs中高表达。因此，最初假设MEMO1参与ROP中血管病理性侵入玻璃体（即IVNV）。目标是靶向MEMO1并减少IVNV，同时促进IRV。

使用培养的hRMVECs，发现VEGF或低氧增加了MEMO1 mRNA的表达，从而支持了MEMO1可能参与ROP的假设。然而，在使用MEMO1 siRNA的时间过程研究中，与对照相比，MEMO1敲低导致VEGFR2持续磷酸化和下游STAT3磷酸化。这与假设相矛盾，反而表明MEMO1可能通过限制VEGFR2介导的VEGFR2和STAT3磷酸化的持续时间而发挥保护作用。使用腺病毒载体过表达MEMO1具有相反的效果，与对照腺病毒载体相比减少了VEGF诱导的VEGFR2和STAT3磷酸化。此外，MEMO1敲低增加了VEGF介导的伤口闭合。然而，MEMO1过表达在一定程度上增加了VEGF诱导的ERK，并在不依赖VEGF的情况下显著增加了AKT激活，表明MEMO1在血管生成中具有超出VEGF诱导信号传导的作用。与这些观察结果一致，MEMO1过表达增加了与对照相比的伤口闭合，且VEGF处理并未进一步增强这一作用。总之，这些发现表明，MEMO1介导的血管生成涉及AKT，并在较小程度上涉及ERK激活，并且在培养的hRMVECs中在有或没有过量VEGF的情况下都会发生。

伤口闭合试验评估了细胞增殖和迁移。为了减少细胞增殖的影响，用丝裂霉素预处理hRMVECs。在这些条件下，VEGF仍增强了伤口闭合，但效果明显低于没有丝裂霉素的试验，表明内皮细胞增殖有助于VEGF诱导的伤口闭合。值得注意的是，在没有VEGF的情况下，MEMO1过表达不再增强伤口闭合，并且在MEMO1过表达的情况下仍然发生VEGF诱导的伤口闭合，但程度低于没有丝裂霉素预处理的实验。这些发现表明，MEMO1影响有效迁移所需的内皮细胞增殖——可能通过AKT信号传导——这一机制值得进一步研究。

然后使用了大鼠ROP模型，该模型再现了人类ROP的IVNV、延迟IRV和毛细血管脱落特征。使用慢病毒载体特异性敲低视网膜内皮细胞中的MEMO1，发现MEMO1敲低增加了IVNV，这也支持了MEMO1抑制VEGF诱导的血管长入玻璃体形成IVNV的假设。来自体外和体内研究的数据支持一个 refined 假设，即MEMO1通过调节STAT3的激活来抑制导致IVNV的VEGFR2持续信号传导的效果。这与之前使用JAK2抑制剂(AG490)或慢病毒递送的针对视网膜内皮细胞中STAT3的shRNA的研究一致，这些研究表明JAK/STAT信号传导在IVNV中很重要。MEMO1抑制内皮细胞中VEGFR2的激活，并减少VEGFR2介导的IVNV。

MEMO1以前未被报道为VEGFR2激活的下游，并且在一项批量RNAseq研究中发现，在培养的hRMVECs中，VEGFR2敲低并未显著改变MEMO1 mRNA。MEMO1表达可能通过不同的VEGF诱导受体，或作为与其他信号机制相互作用的适配器。然而，文献支持VEGFR2作为STAT3激活的上游介质。研究也支持STAT3作为VEGFR2激活的介质，这与体外实验中的时间过程一致。其他研究表明，在非癌细胞和癌细胞系中敲低或敲除MEMO1会导致响应不同刺激（例如EGF、HRG、IGF、PDGF、S1P和雌激素）的细胞迁移与实验对照相比显著减少。即使在人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)中，MEMO1敲低与VEGF响应下的VEGFR2磷酸化或下游效应物的变化无关。在RMVECs中，MEMO1可能通过改变酪氨酸激酶或磷酸酶的活性或定位来调节VEGFR2信号传导。需要进一步的研究，包括邻近连接 assay 和磷酸化蛋白质组学，来阐明MEMO1在RMVECs中调节VEGFR2磷酸化的精确机制。

数据支持一个假设框架，其中MEMO1作为一种适配器蛋白，调节与ROP病理生理学相关的VEGF依赖性和非依赖性途径。在没有ROP相关应激的情况下（例如PBS对照），MEMO1促进AKT激活，这可能支持生理性发育性IRV。相反，在ROP相关应激下（例如VEGF处理或氧诱导视网膜病变），MEMO1限制VEGFR2磷酸化和下游STAT3信号传导，从而减弱病理性IVNV。这些发现表明，MEMO1具有情境依赖性的调节血管生成的作用（即，在响应体内平衡破坏时抑制病理性血管生长）。

实验性OIR研究在转化到人类ROP方面存在局限性。此外，对人类早产儿的研究在确定细胞或分子水平的机制方面存在限制。为了与人类婴儿信号通路可转化，选择分析培养的hRMVECs和大鼠RMVECs来解决内皮细胞中的假设。然而，人类ROP是多因素的，涉及血管生成信号传导、炎症、氧化应激和多种细胞类型中的免疫激活之间复杂的相互作用。因此，需要未来研究探索MEMO1在ROP中的炎症、氧化和神经退行性机制中的作用。大鼠ROP模型代表了人类ROP，特别是在研究IRV和IVNV的影响时。使用慢病毒敲低而非敲除大鼠ROP模型中的表达模拟了恢复体内平衡的信号传导调节。慢病毒插入细胞核以允许发育中的内皮细胞持续表达shRNA。然而，与所有实验性ROP模型一样，大鼠幼崽不是早产的，并且该模型会自然经历疾病特征的消退，而不像人类早产儿那样疾病复发。此外，体内研究的实验设计要求大鼠ROP模型在视网膜下注射时非常短暂地中断氧应激。中断大鼠ROP模型的氧应激可能减少了观察到的ROP特征的影响。未来，将考虑其他方法来调节MEMO1表达并评估额外的时间点。此外，证明了MEMO1在内皮细胞以外的其他视网膜细胞（例如光感受器）中也有表达；因此，需要未来研究确定MEMO1在其他视网膜细胞类型中的作用以及可能阐明ROP病理生理学事件的潜在相互作用。

结论

提供了证据表明MEMO1似乎抑制了hRMVECs中VEGFR2介导的STAT3激活，并且可能在防止ROP中的病理性IVNV方面很重要。表明MEMO1与AKT相互作用，并可能直接或间接与其他VEGF触发的信号通路相互作用，但似乎独立于某些VEGF效应。研究通过使用一个代表ROP的模型，深入了解了这种适配器蛋白对VEGFR2诱导的IVNV的作用——突出了防止第二阶段ROP的潜在治疗靶点。需要未来的研究来阐明视网膜内皮MEMO1影响发育性和病理性血管生成的机制。