模拟真实运动间歇性特征的电脉冲刺激调控健康人源肌管代谢与分泌谱系

本刊推荐：本研究创新性地设计了一种间歇性电脉冲刺激（EPS）方案，模拟真实运动的高强度间歇特性，系统揭示了其在调控原代人类肌管葡萄糖/脂肪酸氧化代谢、肌因子（IL6、IL8、GDF11）表达及细胞外囊泡（EVs）分泌方面的独特作用。相比传统连续刺激，间歇性EPS更显著促进底物完全氧化（CO2生成），而连续刺激则更强诱导收缩相关性肌因子释放。该模型为体外研究运动适应性代谢重组和肌肉分泌组提供了生理相关性更强的技术平台。

　　

材料与方法

研究获得布拉迪斯拉发大学医院伦理委员会批准（协议号2.1.1-6），所有志愿者签署知情同意书。骨骼肌活检取自代谢健康的非肥胖男性（表1），通过Bergstr?m技术获取股外侧肌样本。卫星细胞经胰蛋白酶消化分离后，在含15%胎牛血清（FBS）的DMEM低糖培养基中预铺板去除成纤维细胞，随后接种于胶原包被的T-25培养瓶扩增。细胞冻存于液氮，实验时解冻接种于6孔板（RNA/蛋白质分析）和12孔板（代谢测定）。分化诱导采用含2% FBS、25 pM胰岛素（Ins）的α-MEM培养基。共进行4次独立实验，每次使用单一供体细胞。

电脉冲刺激使用C-Pace EP刺激系统，于分化第5天实施两种方案：（1）连续刺激（CS）：1 Hz频率，2 ms脉冲时长，持续24 h；（2）间歇刺激（IS）：30 min高频刺激（5 Hz，4 ms脉冲）与4 h低频恢复期（0.2 Hz）交替循环，电场梯度统一为1.1 V/cm2。每个循环以5 min静息期结束，24 h内完成5个循环（图1）。对照组（CON）电极浸入培养基但不连接刺激器。细胞于刺激结束后立即收取。

葡萄糖代谢检测采用D[U-¹⁴C]葡萄糖示踪，测定CO₂生成（完全氧化）和糖原合成速率；脂肪酸代谢使用[1-¹⁴C]-棕榈酸耦合BSA，分析CO₂、酸溶性代谢物（ASMs）及脂质合成（薄层色谱法分离磷脂PL、甘油二酯DAG、甘油三酯TAG）。数据均以蛋白质含量标准化。

RNA提取使用Qiazol试剂，qPCR以β2-微球蛋白和GAPDH为内参（引物见表S2）。蛋白质免疫印迹分析线粒体氧化磷酸化（OxPHOS）复合物（抗体 cocktail ab110413）、GDF11（ab71347）及HSP90（加载对照）。培养基中IL6、IL8浓度通过ELISA测定，乳酸脱氢酶（LDH）活性评估细胞损伤。

细胞外囊泡（EVs）从50 mL条件培养基中分离：差速离心去除细胞碎片后，使用ExoQuick-TC?沉淀EVs。纳米粒子追踪分析（NTA）测定粒径和浓度，透射电镜（TEM）观察形态特征，蛋白质组学（DIA-MS/MS）鉴定EVs cargo蛋白，数据提交至PRIDE（PXD059967）。

统计采用GraphPad Prism 9.5.1和RStudio，正态数据使用单因素ANOVA与Tukey多重比较，非参数数据采用Friedman检验。显著性阈值设为P<0.05。

结果

代谢适应性重组

间歇性EPS（IS）显著提升肌管葡萄糖氧化（CO₂生成）和糖原合成速率（图2A,B），而连续刺激（CS）仅促进糖原合成，未增强氧化代谢。总葡萄糖处置率在两种方案下均增加（图2C），胰岛素刺激进一步强化糖原合成能力（图2D–F）。脂肪酸氧化中，IS同时促进完全氧化（CO₂）和不完全氧化（ASMs积累），总FOx速率上升；CS仅增加ASMs积累（图3A–C）。CS降低棕榈酸掺入TAG和PL的趋势，IS无此效应（图3D–F）。

线粒体与纤维类型标志物

两种EPS方案均上调氧化型肌纤维标志物MYH2（IIa型）和MYH7（I型）基因表达（图4A,B），但对糖酵解纤维标志物MYH1（IIx型）和线粒体生物发生调控因子PGC1α mRNA无影响（图4C,D）。OxPHOS复合物蛋白总量未发生显著变化（图4E；图S1），提示24 h刺激不足以诱导线粒体结构重塑。

肌因子表达与分泌

CS显著诱导IL6基因表达和蛋白分泌（图5A–D），IL8释放增加但基因调控不显著；IS对二者无影响。GDF11蛋白在两种方案下均增加（图5F；图S2），但未检测到其胞外分泌，基因表达因个体差异未达显著性（图5E）。

细胞外囊泡释放

TEM显示EVs为直径约100 nm的膜包被球形结构（图6A）。NTA测定基线EVs释放量为3.1×10¹¹颗粒/mL/mg蛋白，CS和IS分别增加41%和26%（图6B）。蛋白质组学鉴定出4164种蛋白，含外泌体标志物CD63、CD81、TSG101和Alix，但未检出IL6、IL8或GDF11。

讨论

本研究通过对比间歇性与连续性电脉冲刺激，揭示了运动模拟方案在代谢和分泌调控中的模式特异性：IS优先增强底物完全氧化能力，反映其更接近真实运动的高强度间歇特性；CS则强效诱导收缩相关性肌因子（如IL6）释放，可能与持续低强度收缩的代谢压力相关。GDF11作为TGF-β家族成员，在蛋白水平响应EPS调控，支持其作为运动调控因子的潜力，但需进一步验证其分泌机制。EVs释放增加印证了肌肉收缩参与细胞间通讯的生理过程，且其蛋白质组复杂性为研究运动依赖性分子传递提供了资源。

现有文献中EPS对代谢的效应存在异质性，可能与刺激参数（频率、时长、电压）、供体表型（健康 vs. 代谢疾病）及检测时间点相关。本研究突出时间动态的重要性：IS后3 h收获细胞处于代谢恢复期，可能解释其肌因子释放弱于CS。此外，人类原代肌管体外培养时偏向糖酵解表型，可能是脂肪酸氧化响应相对较弱的原因。

结论

间歇性EPS更有效模拟真实运动的代谢适应性（增强葡萄糖/脂肪酸完全氧化），而连续性EPS更强诱导肌因子分泌和EVs释放。人类原代肌管模型适用于研究运动相关代谢重组、肌肉分泌组及细胞间通讯机制。GDF11的收缩依赖性表达为其作为运动调控因子提供了新证据。

研究局限性

表型分析限于特定时间点，未能捕捉动态过程；供体临床背景差异（如肥胖/糖尿病家族史）可能贡献数据变异；样本量较小可能降低部分指标的统计效力。