鸡胚胎干细胞向原始生殖细胞样细胞分化的两步诱导体系建立与优化及其在遗传资源保护中的应用

《FEBS Open Bio》：Establishment and optimization of the two-step induction system for generating primordial germ cell-like cells from chicken embryonic stem cells

本综述系统阐述了通过优化培养条件（添加2i因子）成功获得并验证了鸡胚胎干细胞（ESCs）的多能性克隆，进而利用bFGF、activin A和1% KSR诱导ESCs分化为类外胚层细胞（EpiLCs），最后通过评估BMP4、BMP8b、EGF、LIF和SCF的不同组合，高效诱导EpiLCs分化为原始生殖细胞样细胞（PGCLCs）。研究证实诱导的PGCLCs表达Cvh、C-kit、Dazl等标志物，并具备体内迁移和定殖能力，为禽类遗传资源保存技术提供了新策略。

　　

鸡胚胎干细胞的培养与鉴定

研究首先通过添加2i因子（MEK抑制剂PD0325901和TGFβ抑制剂SB431542）优化了鸡胚胎干细胞（ESCs）的培养体系。形态学观察显示，优化后的ESCs克隆呈现典型集落形态且更易聚集成团。碱性磷酸酶（AKP）染色和阶段特异性胚胎抗原-1（SSEA-1）免疫荧光检测结果均为阳性，表明细胞具有早期胚胎细胞特征。qRT-PCR分析显示多能性基因NANOG、SOX2和OCT4的表达显著高于阴性对照DF1细胞（P < 0.05），证实ESCs保持未分化状态和多向分化潜能。

ESCs向类外胚层细胞的分化与鉴定

采用含25 ng·mL^?1 Activin A、10 ng·mL^?1 bFGF和1% KSR的诱导培养基处理ESCs。诱导第2天时细胞形成单层贴壁集落，且基因表达谱与原始外胚层细胞最为相似：外胚层标志基因PAX6、中胚层相关基因EOMES和VIM表达上调，而多能性基因NANOG和OCT4表达降低。SSEA-1免疫荧光检测证实诱导后的类外胚层细胞（EpiLCs）仍保留多能性。

EpiLCs向原始生殖细胞样细胞的分化

研究设计了四种诱导组合（见表3），其中条件2（BMP4+BMP8b+EGF+LIF+SCF）效果最优。形态学观察发现诱导过程中类胚体（EBs）数量先增后减，第6天达到峰值。qRT-PCR显示生殖系特异性基因CVH、KIT和DAZL的表达在第6天显著高于其他组。流式细胞术检测CVH阳性细胞率显示条件2诱导效率最高（43.7%），显著优于条件1（28.1%，P < 0.01）。

PGCLCs的免疫荧光鉴定

第6天诱导细胞经CVH和DAZL抗体染色后，胞浆分别呈现红色和绿色荧光，阴性对照EpiLCs无特异性染色。信号清晰且与DAPI染色的细胞核形成明显对比，证实PGCLCs表达生殖细胞特异性蛋白。

PGCs与PGCLCs的长期培养与鉴定

采用FACS系统长期培养PGCLCs至第8代（约25天），细胞仍保持高增殖率和典型形态。免疫荧光检测显示长期培养的PGCLCs、40天和180天PGCs均表达CVH和SSEA-1，核型与天然PGCs相似，表明诱导细胞具备生殖细胞特性和基因组稳定性。

PGCLCs的体内迁移能力检测

PKH26标记的P8代PGCLCs和PGCs注射至2.5天鸡胚血管后，7-7.5天时在受体性腺中观察到荧光细胞。统计显示PGCs迁移率为56.5%，PGCLCs为42.9%，证明诱导细胞具备体内迁移和定殖能力。

讨论与展望

本研究通过优化培养体系（添加2i因子）和阶段性细胞因子诱导（bFGF/Activin A诱导EpiLCs，BMP家族因子联合LIF/SCF诱导PGCLCs），建立了高效的鸡PGCLCs体外诱导体系。与哺乳类研究相比，禽类生殖细胞定向分化研究仍处于起步阶段。未来需探索禽类特异性分化策略，进一步提高in vitro生殖细胞重建效率。该技术为濒危禽类种质资源保存、基因编辑育种和生殖工程提供了新途径。

结论

研究成功建立了无饲养层鸡ESCs培养体系，并通过两步法诱导获得具有生殖细胞特性和体内迁移能力的PGCLCs。条件2（BMP4+BMP8b+EGF+LIF+SCF）为最优诱导方案，为禽类遗传资源保护与利用提供了关键技术支撑。