层粘连蛋白332通过整合素α6β4信号通路调控脊髓发育中星形胶质细胞成熟与GFAP表达的作用机制

本文揭示了层粘连蛋白332（Laminin 332）在脊髓白质发育中的关键作用：其通过整合素α6β4信号通路促进星形胶质细胞前体细胞分化，上调胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达，并抑制细胞增殖。该发现为脊髓损伤再生治疗提供了新的分子靶点和理论依据。

　　

引言

脊髓作为中枢神经系统的重要组成部分，其白质区域负责感觉和运动信号传导。白质主要由轴突束组成，在发育过程中通过边缘区的扩张形成。尽管已知导向和粘附分子对神经束的建立至关重要，但细胞外基质（ECM）在白质发育中的具体作用尚不明确。层粘连蛋白作为ECM的主要成分，在神经系统发育中发挥多种调控功能。本研究旨在探究层粘连蛋白332在脊髓发育过程中的分布与功能。

方法

研究使用C57BL/6JJcl小鼠胚胎，采集E12、E14、E16和E18时间点的脊髓组织。通过免疫组织化学分析层粘连蛋白亚型的表达分布，Western blot和RT-PCR验证蛋白及基因表达水平。采用DiI追踪技术标记投射至边缘区的神经元，RNAscope原位杂交检测Lama3 mRNA表达。使用OS3胶质祖细胞系和原代脊髓胶质细胞进行体外培养，通过CCK-8法检测细胞增殖，免疫细胞化学分析GFAP表达。整合素阻断实验使用抗整合素α6、β4及α3β1抗体。

结果

层粘连蛋白332在发育中脊髓白质的定位

免疫组化分析显示，层粘连蛋白α3在E12和E14胚胎脊髓边缘区（未来白质区域）显著表达，但在E16和E18表达减弱。进一步检测发现层粘连蛋白β3而非β1或β2γ1在该区域共表达，Western blot和RT-PCR证实了层粘连蛋白α3和β3在E14和E16脊髓中的表达，表明层粘连蛋白332特异性存在于发育中的脊髓白质。

层粘连蛋白α3对轴突的覆盖

E12时期边缘区细胞核稀少，Tuj1染色显示该区域内存在头尾走向的神经轴突。层粘连蛋白α3呈点状表达并包绕这些轴突，提示层粘连蛋白332可能由特定神经元分泌并沉积于轴突周围。

投射至边缘区的神经元表达层粘连蛋白α3 mRNA

DiI标记实验发现，投射至胸段脊髓边缘区的神经元分布于同侧前角、对侧后角和同侧脑干。原位杂交在E14脊髓前角、后角和脑干检测到Lama3 mRNA信号，证实这些神经元能够合成层粘连蛋白α3，进而形成层粘连蛋白332并沉积于其轴突经过的边缘区。

发育中脊髓外周GFAP表达增加

免疫组化显示，GFAP阳性纤维在E12和E14时期与层粘连蛋白α3表达区域重叠，主要位于边缘区。到E16和E18，边缘区GFAP阳性细胞数量显著增加，表明星形胶质细胞在该区域分化成熟。

层粘连蛋白332诱导星形胶质细胞前体细胞GFAP表达

体外实验表明，在层粘连蛋白332上培养的OS3细胞较层粘连蛋白511或纤连蛋白组表现出更高的GFAP荧光强度，且细胞增殖受到抑制。CCK-8法证实层粘连蛋白332涂层上的OS3细胞增殖率更低。

阻断整合素α6β4抑制层粘连蛋白332对OS3细胞的作用

整合素阻断实验显示，抗整合素α6抗体处理可恢复OS3细胞在层粘连蛋白332上的增殖能力。免疫细胞化学分析表明，抗整合素α6或α6β4抗体处理显著降低GFAP表达，提示层粘连蛋白332通过整合素α6β4信号通路调控星形胶质细胞分化和GFAP表达。

层粘连蛋白332诱导原代脊髓胶质细胞GFAP表达

原代培养的E15脊髓胶质细胞在层粘连蛋白332涂层上表现出更高的GFAP表达水平和GFAP阳性细胞比例，进一步验证了层粘连蛋白332对星形胶质细胞分化的促进作用。

讨论

本研究首次报道了层粘连蛋白332在胚胎脊髓发育特定阶段边缘区的表达模式。结果表明，脑干和脊髓神经元合成层粘连蛋白332并沉积于其轴突周围，为白质形成提供适宜的微环境。层粘连蛋白332通过整合素α6β4信号通路促进放射状胶质细胞向GFAP阳性的纤维状星形胶质细胞分化，并抑制细胞增殖，这可能是白质中纤维状星形胶质细胞特性形成的重要机制。

层粘连蛋白332表达随时间动态变化，其在轴突延伸阶段高表达，随着星形胶质细胞分化成熟而下降，提示其功能具有发育阶段特异性。该发现为脊髓损伤修复提供了新思路：调控层粘连蛋白332信号可能有助于减轻胶质瘢痕形成并促进轴突再生。未来研究需进一步探讨层粘连蛋白332对轴突生长的直接影响及其在脊髓损伤修复中的潜在应用价值。