布鲁氏菌病新型基因缺失疫苗A19ΔBtpB：增强保护力与诊断鉴别能力的双重突破

本刊推荐：本研究通过同源重组技术成功构建布鲁氏菌A19ΔBtpB基因缺失株，证实该突变株在保持良好安全性的同时，显著增强TLR2/TLR4介导的细胞免疫应答，促进Th1型细胞因子（IL-6、TNF-α、IFN-γ）分泌并抑制Th2型细胞因子（IL-4、IL-10）。研究首次建立基于BtpB蛋白的间接ELISA（iELISA）鉴别方法，有效区分疫苗免疫与自然感染群体，为布鲁氏菌病（Brucellosis）防控提供兼具增强保护效力与诊断鉴别能力的双功能疫苗候选株。

　　

引言

布鲁氏菌病作为全球性人畜共患病，在发展中国家尤其流行。当前广泛使用的布鲁氏菌流产减毒活疫苗A19株虽能有效控制牛群传播，但仍存在潜在感染风险、孕畜流产以及疫苗接种与自然感染难以鉴别等缺陷。布鲁氏菌作为专性胞内寄生菌，其IV型分泌系统（T4SS）效应蛋白BtpB被证实可通过抑制Toll样受体（TLR2/TLR4）信号通路介导免疫逃逸。本研究旨在通过敲除A19株的btpB基因，开发兼具增强保护力和诊断鉴别能力的新型基因工程疫苗。

材料与方法

通过同源重组技术成功构建A19ΔBtpB缺失株，并利用原核表达系统获得纯度＞85%的重组BtpB蛋白。采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7评估菌株侵袭与胞内存活能力，通过ICR小鼠模型进行免疫保护评价。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测脾淋巴细胞TLR及细胞因子mRNA转录水平，ELISpot和流式细胞术分析IFN-γ分泌及T淋巴细胞亚群。建立基于BtpB的间接ELISA（iELISA）鉴别方法，并采用组织病理学（H&E染色）评估脏器损伤情况。

结果

1. 1.

   菌株构建与蛋白表达

   成功获得A19ΔBtpB缺失株，PCR验证显示突变株扩增片段为1817 bp，亲本株为1605 bp。Western blot证实重组BtpB蛋白具有34.9 kDa的特异性条带。生长曲线与应激试验表明基因缺失不影响菌株体外增殖及耐酸、耐热等生物学特性。

2. 2.

   安全性评价

   免疫小鼠21天内，A19ΔBtpB组血清丙氨酸转氨酶（ALT）和乳酸脱氢酶（LDH）水平显著低于亲本株组（p<0.05），体质量增长与脾指数无统计学差异。脾脏细菌载量检测显示两组定殖能力相当，证实缺失株安全性良好。

3. 3.

   免疫机制研究

   qRT-PCR结果显示：A19ΔBtpB组TLR2/TLR4 mRNA表达水平在免疫14/21天显著上调（p<0.05）。细胞因子谱分析表明：缺失株促进Th1型应答，IL-6、TNF-α表达显著增高（p<0.01），同时抑制Th2型细胞因子IL-4、IL-10分泌（p<0.001）。ELISpot与流式细胞术证实：缺失株诱导的IFN-γ⁺CD4⁺/CD8⁺T细胞比例显著高于亲本株组（p<0.05）。

4. 4.

   保护效力评估

   用羊种布鲁氏菌M28强毒株（2×10⁵ CFU）攻毒后，A19ΔBtpB组脾指数显著低于亲本株组（p<0.01），脾脏细菌清除率提高（保护单位5.35 vs 4.19）。组织病理学显示：缺失株组肝细胞损伤减轻，炎性细胞浸润局限，脾脏白髓结构完整且巨噬细胞密度增加。

5. 5.

   鉴别诊断应用

   基于BtpB蛋白建立的iELISA方法显示：A19ΔBtpB免疫组OD₄₅₀值显著低于A19疫苗株、M5疫苗株及M28野毒株感染组（p<0.001），可有效区分疫苗接种与自然感染。

讨论

本研究首次系统阐明BtpB基因缺失对布鲁氏菌A19疫苗株免疫调控机制的影响。缺失株通过解除对TLR通路的抑制，重塑Th1/Th2平衡，增强IFN-γ介导的细胞免疫应答。建立的BtpB-iELISA鉴别方法克服了传统疫苗干扰血清学诊断的难题。组织病理学结果从脏器保护层面验证了缺失株的优越性。

结论

A19ΔBtpB缺失株作为新型布鲁氏菌基因工程疫苗候选株，兼具增强保护效力与诊断鉴别双重功能，为布鲁氏菌病防控提供新策略，具有重要理论价值与应用前景。