乳酸片球菌BBS1全基因组测序分析：从老挝发酵竹笋中分离的潜在益生菌株安全性评估及其功能基因鉴定

本刊推荐：本研究采用全基因组测序(WGS)技术对老挝发酵竹笋分离株Pediococcus pentosaceus BBS1进行系统分析，证实其不含毒力因子(VF)、生物胺(BA)及抗生素抗性(AMR)基因，同时鉴定出乳酸脱氢酶(LDH)和β-葡萄糖苷酶(linamarase)等关键功能基因，为开发安全高效的益生菌发酵剂提供了分子依据。

　　

1 引言

益生菌食品作为功能性食品在全球市场价值已达465.5亿美元（2020年）。乳酸菌（LAB）中的片球菌属（Pediococcus）因能产生抗菌物质（如片球菌素、有机酸等）且具备益生特性（耐胃酸胆汁、细菌黏附、抗菌活性等），被广泛用于食品发酵工业。Pediococcus pentosaceus因其安全特性和对发酵产品品质的改善作用，已成为食品生物防腐的潜在候选菌种。全基因组测序（WGS）技术的应用使得研究人员能够深入探究LAB的分子分类学、代谢特性及生物活性物质，同时为菌株安全性评估提供了新方法。欧洲食品安全局（EFSA）强调，用于食品的活菌益生菌必须经过严格的安全性评估，包括毒力因子、耐药基因及生物胺产生能力的检测。

2 材料与方法

2.1 菌株与培养条件

Pediococcus pentosaceus BBS1分离自老挝传统发酵竹笋（Nor Mai Som），于MRS培养基中37°C培养18-24小时，甘油保存于-80°C。

2.2 全基因组测序分析

2.2.1 DNA提取与质检

采用Quick-DNA试剂盒提取基因组DNA，经NanoDrop检测纯度（OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.8-2.0），琼脂糖凝胶电泳验证完整性。

2.2.2 测序与组装

使用Illumina HiSeq 2500平台进行测序，经Trimmomatic过滤低质量读段（Q<30），通过Unicycler和PATRIC进行de novo组装。

2.2.3 基因预测与功能注释

采用RAST服务器进行基因预测和功能注释，通过PATRIC绘制环状基因组图谱。

2.2.4 物种鉴定

通过16S rRNA序列和平均核苷酸一致性（ANI）分析（阈值95-96%）确认菌种，使用ContEst16S和OAT工具验证。

2.3 生物信息学安全性评估

2.3.1 毒力因子、生物胺与耐药基因检测

使用VFDB数据库（阈值：同一性>80%，覆盖度>60%）筛查毒力基因；通过RAST-KEGG分析生物胺合成途径；利用ResFinder、CARD和RAST-KEGG鉴定抗生素抗性（AMR）基因。

2.3.2 移动遗传元件分析

通过oriTfinder检测接合转移起始位点（oriT），利用PHASTER预测前噬菌体区域。

3 结果

3.1 基因组基本特征

BBS1基因组为1,840,613 bp环状染色体，GC含量37.23%，包含1778个蛋白编码序列（CDS）、54个tRNA和3个rRNA。子系统注释显示蛋白质代谢（197个基因）和碳水化合物代谢（178个基因）最为丰富。

3.2 物种鉴定

ANI分析显示BBS1与P. pentosaceus SL4相似度达99.60%，16S rRNA分析进一步确认其分类地位。

3.3 乳酸合成基因

RAST-KEGG分析鉴定出d-乳酸脱氢酶（ldhA, EC 1.1.1.28）和l-乳酸脱氢酶（ldh, EC 1.1.1.27）基因，分别位于996 bp和963/921 bp区域，表明其具备高产乳酸潜力。

3.4 氰化物降解基因

β-葡萄糖苷酶（linamarase, EC 3.2.1.21）和6-磷酸-β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.86）基因被识别，与参考菌株P. pentosaceus ATCC 25745结构相似，证实其氰苷降解能力。

3.5 安全性评估

3.5.1 毒力因子

VFDB未检出典型毒力基因，但OriTfinder发现应激生存基因（ClpP）、免疫调节基因（hasABC）和胆盐水解酶基因（bsh），这些与适应性相关而非致病性。

3.5.2 生物胺基因

RAST-KEGG分析未发现任何生物胺（组胺、酪胺、尸胺等）合成相关基因。

3.5.3 耐药基因

ResFinder未检出AMR基因，但RAST检出β-内酰胺酶基因（K17836），CARD显示万古霉素抗性基因（vanT, 32.43%同一性）和季铵盐抗性基因（qacJ, 48.57%同一性），均为低风险固有抗性。

3.5.4 移动遗传元件

未检测到接合转移oriT位点；PHASTER发现1个完整和2个不完整前噬菌体区域，均未携带AMR/毒力基因。

4 讨论

BBS1此前研究显示其对人工胃肠液耐受、抗菌及抗氧化活性，本次WGS分析进一步从基因组层面验证其安全性。高丰度的蛋白和碳水化合物代谢基因支持其作为发酵剂的代谢基础。乳酸脱氢酶基因的存在为其应用于聚乳酸（PLA）生物材料生产提供可能。linamarase基因为食品工业中氰苷解毒提供了酶学基础，可用于改善发酵食品风味。安全性方面，毒力因子缺失、生物胺基因阴性以及移动遗传元件的低风险性，符合EFSA益生菌安全标准。β-内酰胺酶基因的存在需结合表型验证，但固有抗性（如万古霉素）在LAB中常见且不可转移。

5 结论

Pediococcus pentosaceus BBS1具备完整的乳酸合成和氰苷降解基因谱系，且无安全性风险基因，可作为安全高效的益生菌发酵剂用于食品工业。其基因组数据为后续遗传改造（如强化乳酸或linamarase产量）提供了理论依据。

作者贡献与致谢

Viengvilaiphone Botthoulath负责实验设计与论文撰写；Ida F. Dalmacio和Francisco B. Elegado指导研究并修改文稿；Lawrence Yves Uy参与基因组分析；Hsiang-Chun Lin提供生物信息学支持。研究由SEARCA和菲律宾大学BIEEP实验室支持，台湾大学提供出版资助。