人类骨骼肌活检样本保存技术评估：冻干法、RNAlater与RNAlater-ICE在生化分析中的比较研究

本文系统比较了冻干法（FD）、RNAlater（LAT）及三种RNAlater-ICE（ICE）衍生方案对人类骨骼肌样本生化指标的影响。研究发现，ICE处理完全抑制柠檬酸合酶（CS）活性，显著降低支链氨基酸（BCAA）浓度和总蛋白提取效率；LAT虽保留CS活性，但导致氨基酸泄漏和蛋白溶解度改变。结果强调保存方法选择对下游生化分析（如酶活性、代谢物检测和蛋白质印迹）的敏感性，为肌肉生理学研究提供关键方法学参考。

　　

2 材料与方法

2.1 伦理批准

本研究使用的肌肉活检样本来自经瑞典伦理审查局批准的项目（DNR 2019-02194），所有参与者均签署知情同意书。

2.2 肌肉活检取样与组织保存

样本取自三名健康活跃个体的股外侧肌（vastus lateralis），在空腹静止状态下通过Bergstr?m针采集。样本立即称重并分为五份，分别进行以下处理：

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  RNAlater组：样本浸于预冷RNAlater溶液（10倍体积），4°C保存48小时后转至-30°C。

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  冻干组（FD）：液氮速冻后冷冻干燥过夜。

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  RNAlater-ICE组：分为三种衍生方案：

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    ICE：直接浸于RNAlater-ICE溶液（-30°C，48小时）；

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    ICE-LAT：ICE处理后转移至RNAlater溶液（-30°C，16小时）；

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    ICE-LAT-LB：ICE-LAT处理后转移至不含Triton X-100的裂解缓冲液（冰上2小时）。

    所有转移步骤均通过滤纸吸干以减少溶液残留。

2.3 匀浆与样本制备

样本在裂解缓冲液中通过Bullet Blender均质化，缓冲液含HEPES（40 mM, pH 7.5）、EDTA（1 mM）、NaCl（120 mM）、蛋白酶和磷酸酶抑制剂。匀浆后分装用于后续分析，部分样本经离心（10,000 g, 10分钟）获得上清液。蛋白浓度通过Pierce 660 nm assay测定。

2.4 柠檬酸合酶活性检测

采用分光光度法测定柠檬酸合酶（CS）活性，以DTNB为底物，在412 nm波长下监测反应速率。

2.5 糖原含量测定

通过 amyloglucosidase 消化糖原释放葡萄糖，再经 hexokinase/G6PDH 偶联反应荧光检测葡萄糖浓度。

2.6 氨基酸浓度分析

上清液经三氯乙酸脱蛋白后，通过AccQ Tag Ultra衍生化试剂盒处理，使用LC-MS/MS定量氨基酸。

2.7 SDS-PAGE与蛋白质印迹

样本按蛋白浓度调整后上样，转膜至PVDF膜，MemCode?染色验证转膜效率，一抗孵育后通过化学发光法显影。

2.8 抗体信息

使用抗体包括：mTOR、S6K1、eEF2、CS、Pan Actin、p-eEF2（Cell Signaling Technology）、RPS6（Santa Cruz）、Fast Myosin和NDUFB8（Abcam）。

2.9 统计学分析

采用Friedman重复测量ANOVA与Durbin-Conover事后检验，显著性水平设为p< 0.05。

3 结果

酶活性与代谢物提取

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  柠檬酸合酶活性：FD与LAT组活性相近（51 vs. 54 μmol·min^?1·g^?1），而所有ICE方案均完全抑制CS活性（0.0–1.1 μmol·min^?1·g^?1）。

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  糖原含量：所有组间无显著差异（442–494 mmol·kg dw^?1）。

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  支链氨基酸（BCAA）：所有LAT/ICE处理均显著降低BCAA浓度（52%–73% vs. FD）。

蛋白浓度分析

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  粗裂解液蛋白浓度：FD与LAT组相近（6.29 vs. 6.32 μg·μL^?1），ICE方案降低30%–41%。

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  上清液蛋白浓度：LAT组较FD升高39%，而ICE方案降低38%–56%。

蛋白质印迹验证

Western blot显示ICE组蛋白沉淀现象，总蛋白染色强度高于FD组，但CS蛋白含量未受影响。上清液中ICE组的肌球蛋白（myosin）完全沉淀，而LAT组溶解度增加。

4 讨论

本研究首次系统评估RNAlater与RNAlater-ICE在肌肉样本生化分析中的适用性。关键发现包括：

1. 1.

   RNAlater-ICE的酶活性抑制：因其含乙醇类成分，直接变性CS等酶类，且后续处理无法逆转该效应。

2. 2.

   代谢物泄漏：LAT与ICE均导致BCAA泄漏至保存液中，但糖原检测因高度稀释未受影响。

3. 3.

   蛋白提取偏差：ICE引起蛋白沉淀，干扰比色法蛋白定量；LAT则增加蛋白溶解度，尤其肌球蛋白和核糖体蛋白S6（RPS6）。

4. 4.

   方法学建议：ICE不适用于酶活性或蛋白/代谢物提取研究；LAT需谨慎用于氨基酸和蛋白分析。

本研究突显保存方法对下游数据可靠性的影响，为肌肉生理学实验设计提供关键依据。