cfr(B)介导的艰难梭菌利奈唑胺耐药机制研究：Tn6218转座子的水平传播与临床意义

本研究发现临床艰难梭菌（C. difficile）中cfr(B)基因通过Tn6218转座子介导高水平利奈唑胺耐药（MIC≥16μg/mL），揭示其与粪肠球菌（E. faecium）的同源性，强调需监测肠球菌与艰难梭菌间耐药基因水平传播以控制公共卫生风险。

　　

Abstract

Background

艰难梭菌（Clostridioides difficile）对利奈唑胺呈现高最小抑菌浓度（>4μg/mL）的临床报道较为罕见。值得注意的是，利奈唑胺耐药艰难梭菌的流行率极低（中国分离株中<3%），且其遗传决定机制尚未明确。

Methods

本研究通过基因组学方法探究高利奈唑胺MIC艰难梭菌的遗传特征。采用抗菌药物敏感性试验测定利奈唑胺MIC并描绘耐药谱。通过全基因组测序分析多位点序列分型（MLST）、耐药基因及耐药株cfr基因特征。使用Roary构建泛基因组系统发育树，并通过BEAST.4进行贝叶斯进化分析。

Results

在421株艰难梭菌分离株中，9株（2.1%）呈现高利奈唑胺MIC（≥16μg/mL），包括6株ST37（A-B+）和3株ST3菌株（2株A-B-）。所有菌株均携带位于Tn6218转座子上的cfr(B)基因，与粪肠球菌（E. faecium NG_050395.1）具有同源性。

Conclusion

本研究强调cfr(B)通过可移动遗传元件在临床环境中传播的风险，呼吁监测肠球菌与艰难梭菌中的共存现象以遏制耐药性传播。

Introduction

利奈唑胺作为恶唑烷酮类抗生素的首个成员，是治疗革兰氏阳性菌感染的重要药物。在中国，该药物被广泛应用于肺炎、腹腔感染和皮肤感染等重症感染的治疗。然而，多项全国性和全球监测计划报道利奈唑胺耐药靶向菌的占比极低，相关耐药主要见于金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌的人类分离株。

耐药机制包括23S rRNA点突变（特别是G2576U）、核糖体蛋白L3（rplC）和L4（rplD）编码基因突变，以及可移动恶唑烷酮耐药基因的存在。其中cfr、optrA、poxtA和poxtA2等基因代表了一种新的非突变型可传播利奈唑胺耐药机制，引起高度关注。cfr编码的rRNA甲基转移酶可对PhLOPS_A类抗生素（酚醛类、林可酰胺类、恶唑烷酮类、截短侧耳素类和链霉素A类）产生耐药。

cfr基因最初于2000年在松鼠葡萄球菌质粒上发现，迄今已在近20种不同遗传环境中检测到。其同源基因已在动物来源的粪肠球菌、芽孢杆菌属和肠杆菌科中发现。推测的cfr样基因（包括cfr(B)、cfr(C)、cfr(D)和cfr(E)）与原始cfr蛋白序列同源性超过50%，均在厚壁菌门内被发现。

艰难梭菌是抗生素相关性腹泻的主要病原体。抗生素使用会破坏胃肠道正常菌群，是艰难梭菌感染（CDI）的主要风险因素。虽然利奈唑胺未被纳入CDI治疗指南，但对多数临床艰难梭菌分离株具有中等活性。部分关键临床试验和观察表明，利奈唑胺可能降低艰难梭菌毒素水平或对CDI具有潜在保护作用。此外，高利奈唑胺MIC菌株的出现仍值得关注，因其可能促进肠道定植和耐药基因向其他临床相关病原体的传播。

根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）和美国临床和实验室标准协会（CLSI）指南，目前尚未建立艰难梭菌对利奈唑胺的临床耐药折点。尽管如此，已有报道显示部分艰难梭菌菌株呈现高利奈唑胺MIC（>4μg/mL）。虽然高MIC菌株较为罕见，但利奈唑胺的临床使用可能增加CDI风险。我们前期的CDI分子流行病学研究发现，1.5%的分离株具有高利奈唑胺MIC，且MIC值存在差异。中国另一项研究报道2.5%的艰难梭菌分离株呈现高利奈唑胺MIC，但未深入探究其机制。

本研究旨在探讨临床艰难梭菌分离株高利奈唑胺MIC的基因组特征及其遗传环境。

Materials and Methods

Bacterial Isolates

本研究在浙江大学医学院附属第一医院（三级甲等教学医院）开展，时间跨度为2009年9月至2022年12月。CDI诊断基于临床表现、培养和毒素基因检测。

疑似CDI腹泻患者的非成形粪便标本送至临床微生物实验室。取0.5mL或0.5g样本与等体积95%乙醇匀浆，室温孵育30分钟进行孢子筛选。使用环丝氨酸-头孢西丁-牛磺胆酸盐琼脂（CCFA-TA）加7%绵羊血的选择性培养基，在厌氧条件（80% N₂、10% H₂、10% CO₂）下37°C培养48小时。通过MALDI-TOF MS（布鲁克 Daltonics Microflex LT系统）鉴定艰难梭菌。

Antimicrobial Susceptibility

采用琼脂稀释法或肉汤稀释法测定十种抗生素（甲硝唑、万古霉素、克林霉素、红霉素、利奈唑胺、莫西沙星、左氧氟沙星、利福平、四环素）的MIC，操作遵循CLSI指南。使用含5%绵羊血、维生素K（10μg/mL）和血红素（5μg/mL）的布鲁氏菌琼脂培养基，在35±1°C厌氧条件下培养48小时。万古霉素耐药折点（>2μg/mL）基于EUCAST流行病学截断值（ECOFFs）。利福平折点参考EUCAST对金黄色葡萄球菌的标准（>0.06μg/mL）。以艰难梭菌ATCC 700057（核型038）作为质控菌株。2009-2022年期间所有培养和药敏试验均严格遵循标准化流程。

Genome Sequencing and Assembly

基于药敏结果，提取高利奈唑胺MIC菌株基因组DNA（FastDNA? Spin Kit for Soil）。使用Illumina NovaSeq 6000平台（Rapid Plus DNA Library Prep Kit）进行全基因组测序，覆盖度达200×。通过FastQC进行数据质控，Trimmomatic去除接头序列。使用SPAdes v3.6进行基因组组装（scaffold N50约0.5Mb，GC含量28.93%）。通过Prokka v1.124进行基因组注释。利用PubMLST数据库确定ST、MLST进化支和毒素基因。

Identification of Antimicrobial Resistance Genes and Transposons

使用耐药基因标识软件（CARD RGI）鉴定耐药基因。通过VRprofile2数据库（序列同源性和覆盖度阈值>80%）检测转座子。

Phylogenetic Analyses of High-Linezolid-MIC Strains

采用Roary进行泛基因组分析并构建系统发育树，通过iTOL可视化进化关系。使用Snippy分析菌株间单核苷酸多态性（SNPs），以CD630（GenBank AM180355）为参考基因组进行比对。基于核心基因组SNPs构建最小跨度树（PHYLOViZ 2.0）。

Bayesian Evolutionary Analysis of Cfr Genes

使用BEAST进行贝叶斯进化分析，每个组合模型运行1亿代，每1万状态采样一次。通过Tracer v1.7.2评估链收敛性和有效样本量，TreeAnnotator v1.10.4构建进化树文件，FigTree v1.4.4可视化。

Comparative Genomic Analysis

通过BLASTn比对cfr及cfr样基因携带 contigs与GenBank数据库序列。使用Geneious Prime软件进行基因对比，Easyfig生成线性基因组比对图。

Results

Epidemiological Characterization of C. difficile Isolates

从5012例腹泻患者中共分离出455株（9.1%）非重复艰难梭菌分离株，其中421株成功复苏并进行药敏试验。9株（2.1%）利奈唑胺MIC≥16μg/mL的菌株来自9例不同患者。6株为ST37（A-B+），3株为ST3（2株A-B-，1株A+B+）。所有高MIC菌株对万古霉素和甲硝唑敏感，但对氟喹诺酮类和利福平普遍耐药。所有ST37菌株均携带gyrA 82位点突变（Thr82Ile），1株ST3菌株左氧氟沙星MIC为32μg/mL并携带类似突变（苏氨酸→缬氨酸）。部分菌株检测到catP、mefH、tetM、ermB和ermG等耐药基因，所有菌株均携带aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia、cdtA和clcD（cfrB）。未发现23S rRNA基因突变（G2576U）或rplC、rplD基因突变/缺失。

泛基因组系统发育树显示ST3和ST37两个进化支。核心基因组SNPs最小跨度树表明所有菌株间SNP差异>2，提示无克隆传播现象。

Genomic Characterization in C. difficile Isolates with High-Linezolid-MIC

与其它物种cfr基因对比显示，本研究菌株仅与屎肠球菌具有较高同源性。贝叶斯进化树表明艰难梭菌cfr(B)基因与艰难梭菌Ox2167（NG_065840.1）和屎肠球菌（NG_050395.1）具有共同祖先，提示潜在种间传播。

Diversity of the Genetic Environment of Cfr(B)

cfr(B)基因位于Tn6218转座子内，包含int（转座酶/整合酶）、xis（切除酶）和rep（调控蛋白）基因。该元件还包含编码多药和毒物外排泵（MATE家族）的开放阅读框。大部分菌株Tn6218结构与艰难梭菌Ox3196相似，s10040802菌株与艰难梭菌Ox2167和屎肠球菌相似，证实了水平传播的可能性。

Discussion

本研究首次系统表征中国临床艰难梭菌高利奈唑胺MIC菌株，重点探讨了cfr(B)基因及其相关Tn6218转座子在多种利奈唑胺耐药菌中的分布。高MIC菌株普遍呈现多药耐药表型，尤其对利福平和氟喹诺酮类耐药。除共存机制外，cfr(B)被确定为我国临床分离株高MIC的主要决定因子。数据表明cfr(B)可通过可移动遗传元件在医疗环境中传播，亟需加强肠球菌与艰难梭菌中该基因共存的监测。

前期研究报道我国艰难梭菌高利奈唑胺MIC分离率较低，而墨西哥报道超过20%。这种地域差异可能与序列型分布差异有关。墨西哥以ST1（NAP1/027）为优势 lineage，且cfr(E)基因特异存在于ST1菌株。本研究中仅ST3和ST37呈现高MIC表型，其余30个ST均未发现。值得注意的是，3株ST3菌株中2株为非产毒株。Candela等同样在非产毒艰难梭菌中发现cfr样基因。这表明共生菌可能作为隐性耐药库，需考虑在高风险临床环境中开展主动监测。基因在艰难梭菌间的可转移性促进了适应性进化（包括水平转移）。

高MIC临床分离株通常与cfr基因相关。本研究所有高MIC菌株均携带cfr(B)基因，与其他报道中cfr(E)或cfr(F)基因占主导的情况不同。且该研究报道主要流行型为ST1，与本研究结果差异显著，这可能是各国分离率不同的原因之一。所有高MIC菌株均对红霉素和克林霉素耐药，与既往观察一致。

erm(B)基因（编码23S rRNA甲基转移酶）是红霉素和克林霉素耐药的重要机制。但本研究发现cfr(B)位于Tn6218转座子内，且超过半数高MIC菌株不携带erm(B)基因。其他研究报道cfr基因可介导多类抗生素（包括红霉素和克林霉素）耐药。针对本研究的差异现象，需进一步证据支持cfr导致多药耐药（包括红霉素和克林霉素耐药）的假说。

不同物种cfr基因对比显示与其它艰难梭菌和屎肠球菌相似，但与金黄色葡萄球菌、解淀粉芽孢杆菌、类芽孢杆菌属、肉毒杆菌和松鼠葡萄球菌等物种存在差异，表明cfr基因的物种多样性。值得注意的是，cfr(B)位于Tn6218内，其结构与屎肠球菌中携带cfr的转座子保守性一致。艰难梭菌和屎肠球菌分离株在耐药基因携带上的相似性强烈提示这些分类学差异物种间cfr(B)基因或其侧翼遗传环境的系统发育相关性。

本研究存在若干局限性：首先，虽然筛选了421株临床分离株，但仅9株呈现高利奈唑胺MIC，且仅发现cfr(B)一种耐药决定因子。这种低流行率仍凸显了持续监测的重要性（尤其需关注中国医院ST1/RT027菌株）。样本量有限可能影响流行病学关联的识别和cfr(B)分布规律的普适性。其次，未同步筛查利奈唑胺耐药肠球菌（特别是屎肠球菌），无法为种间传播假说提供直接证据。最后，单中心设计可能无法全面反映我国利奈唑胺耐药艰难梭菌的流行病学特征，需开展多中心研究获取更代表性数据。

Conclusions

本研究系统表征了中国临床环境中高利奈唑胺MIC艰难梭菌菌株，明确了cfr(B)基因和Tn6218转座子在介导高水平耐药中的关键作用。cfr(B)在临床分离株中的存在提示利奈唑胺使用产生的选择压力，需进一步研究处方模式。此外，cfr(B)与屎肠球菌的有限同源性表明需扩大测序范围以追溯进化起源。

Ethics Approval

本研究经浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会批准（2024年6月3日，批号IIT20240504A），符合赫尔辛基宣言。

Disclosure

作者声明无利益冲突。

Data Sharing Statement

9株艰难梭菌分离株的基因组序列已提交GenBank（BioProject PRJNA432876）并公开。