宏基因组下一代测序揭示老年重症肺炎并发脓胸中的牙龈卟啉单胞菌：病例报告

本研究首次系统揭示了中国临床环境中高利奈唑胺最小抑菌浓度（MIC）艰难梭菌（C. difficile）的分子流行病学特征，通过全基因组测序和进化分析证实cfr(B)基因及其携带转座子Tn6218是介导利奈唑胺耐药（≥16 μg/mL）的核心机制，并发现其与粪肠球菌（E. faecium）同源序列的高度相似性，为医院环境下耐药基因水平传播（horizontal transmission）提供了重要证据。

　　

背景

利奈唑胺作为首个恶唑烷酮类抗生素，是治疗革兰阳性菌感染的重要药物。在中国，利奈唑胺被广泛应用于肺炎、腹腔感染和皮肤感染等严重感染的治疗。然而，全球监测项目报告显示，利奈唑胺耐药的目标细菌比例极低，且主要见于金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌的人类分离株。耐药机制多样，包括23S rRNA基因点突变（如G2576U）、核糖体蛋白L3（rplC）和L4（rplD）编码基因改变，以及可移动的恶唑烷酮耐药基因（如cfr、optrA、poxtA和poxtA2）。其中，cfr基因编码的rRNA甲基转移酶可介导对PhLOPS_A类抗生素（酚醇类、林可酰胺类、恶唑烷酮类、截短侧耳素类和链阳性菌素A）的耐药。

艰难梭菌是抗生素相关性腹泻的主要病原体。抗生素使用会破坏正常的胃肠道菌群，是艰难梭菌感染（CDI）的主要风险因素之一。尽管利奈唑胺未被纳入CDI治疗的临床指南，但它对大多数临床艰难梭菌分离株表现出中等活性。一些关键的临床试验和观察表明，利奈唑胺可能会降低艰难梭菌毒素水平或对CDI具有潜在的保护作用。此外，高利奈唑胺MIC菌株的出现仍然值得关注，因为它可能促进肠道定植和耐药基因向其他临床相关病原体的潜在传播。

目前，根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）和临床与实验室标准协会（CLSI），艰难梭菌尚无利奈唑胺的临床耐药折点。尽管如此，已有一些关于艰难梭菌高利奈唑胺MIC（定义为MIC > 4 μg/mL）的报道。虽然高利奈唑胺MIC的艰难梭菌菌株较少见，但利奈唑胺在临床实践中的常规应用可能带来CDI风险。

材料与方法

本研究在浙江大学医学院附属第一医院（一家三级学术医疗中心）进行，时间从2009年9月开始至2022年12月结束。CDI的诊断基于临床指征，使用培养和毒素基因检测方法。

对腹泻和疑似CDI患者的非成形粪便标本进行收集，并送至临床微生物学实验室。使用0.5 mL或0.5 g样本与等体积95%乙醇均质，室温孵育30分钟以进行孢子选择。使用的选择性培养基是环丝氨酸-头孢西丁-牛磺胆酸盐琼脂（CCFA-TA；Oxoid），并添加7%绵羊血。样本然后在厌氧条件（80% N₂, 10% H₂, 10% CO₂）下37°C培养48小时。分离的菌落使用MALDI-TOF MS分析（Bruker Daltonics Microflex LT系统）鉴定为艰难梭菌。

通过琼脂稀释或肉汤稀释法测定十种抗生素的MIC，包括甲硝唑、万古霉素、克林霉素、红霉素、利奈唑胺、莫西沙星、左氧氟沙星、利福平和四环素，操作遵循CLSI指南。使用含5%纤维绵羊血、维生素K（10 μg/mL）和血红素（5 μg/mL）的布鲁氏菌琼脂（BBL BD, USA）进行培养。抗菌药物敏感性测试的孵育时间严格遵循CLSI指南，所有艰难梭菌分离株在厌氧条件下35±1°C孵育48小时。万古霉素的耐药折点（>2 μg/mL）基于EUCAST指南的流行病学截断值（ECOFFs）。由于艰难梭菌中利福平无折点或ECOFFs，使用EUCAST对金黄色葡萄球菌的折点（>0.06 μg/mL）。艰难梭菌ATCC 700057（核糖型038）作为质量对照。

基于抗菌药物敏感性结果，提取高利奈唑胺MIC菌株的基因组DNA，使用FastDNA? Spin Kit for Soil（MP Biomedicals, Illkirch, France）。全基因组测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行，使用Rapid Plus DNA Library Prep Kit for Illumina（RK20208；Illumina, San Diego, CA, USA），达到200×测序覆盖度。使用FastQC进行序列数据处理和质量控制，使用Trimmomatic修剪接头区域。

预处理后，使用SPAdes基因组组装器v.3.6默认参数组装高质量修剪后的读段，支架N50长度约为0.5 Mb，鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量约为28.93%。使用Prokka v1.124进行基因组注释。使用PubMLST序列查询页面基于组装序列确定ST、多位点序列分型（MLST）进化支分类和毒素基因。

使用综合抗生素耐药性数据库耐药基因标识软件（CARD RGI）鉴定抗菌药物耐药基因。对于转座子检测，使用基本局部比对搜索工具（BLAST）对VRprofile2数据库进行分析，序列同一性和覆盖度阈值设置为大于80%。

为了确定这些表现出高利奈唑胺MIC菌株之间的进化关系，我们使用Roary默认参数进行泛基因组分析并重建系统发育树。使用Interactive Tree of Life网络平台可视化系统发育关系。

还分析了分离株之间的单核苷酸多态性（SNP），以研究SNP系统发育的克隆特征。使用Snippy默认参数进行SNP识别和分析，有助于针对参考菌株CD630（GenBank登录号AM180355）的全基因组序列进行比对。基于核心基因组SNP的成对比较，在PHYLOViZ 2.0中构建最小生成树。

为了分析来自不同物种的不同cfr基因之间的进化关系，使用BEAST进行贝叶斯进化分析，如先前所述。每个组合模型运行三次，共1亿代，每10,000个状态采样一次。使用Tracer v1.7.2检查链的良好收敛性和有效样本量值。使用TreeAnnotator v1.10.4构建进化树文件。使用FigTree v1.4.4生成贝叶斯进化树。

对含有cfr和cfr样基因的contig进行比对分析，使用BLASTn算法针对GenBank数据库中的序列，以阐明它们的基因组背景。使用Geneious Prime软件进行cfr和cfr样基因的比较分析。使用Easyfig生成线性基因组比较图，以清晰表示cfr所在的遗传环境。

结果

从5012名腹泻患者中总共鉴定出455株（9.1%）非重复艰难梭菌分离株。在这455株中，421株成功复苏并进行了抗菌药物敏感性测试。从九名不同的患者中检测到九株（2.1%）利奈唑胺MIC为16 μg/mL或更高的菌株。在这九株高利奈唑胺MIC分离株中，六株被分类为序列型37（ST37），表现出tcdA基因阴性和tcdB基因阳性表型（A-B+）。其余三株分离株被分类为ST3；其中两株缺乏tcdA和tcdB基因（A-B-），一株同时具有这两个基因（A+B+）。

这些高利奈唑胺MIC分离株均对万古霉素和甲硝唑敏感，但大多数对氟喹诺酮类和利福平耐药。本研究中的所有ST37菌株均表现出高水平的莫西沙星耐药，均携带gyrA基因第82密码子突变，导致Thr82Ile（T82I）氨基酸替换。一株ST3分离株对左氧氟沙星的MIC为32 μg/mL，并携带第82密码子的类似突变，导致另一种氨基酸替换（苏氨酸→缬氨酸）。在一些分离株中检测到其他耐药基因，包括catP、mefH、tetM、ermB和ermG，而aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia、cdtA和clcD（cfrB）在所有分离株中均被检测到。此外，除了cfr(B)外，未发现其他已知的耐药机制，如23S rRNA基因点突变（G2576U）或核糖体蛋白L3（rplC基因）和L4（rplD基因）的突变或缺失。

泛基因组系统发育树揭示了两个进化支：ST3进化支和ST37进化支。然后构建了一个最小生成树，基于核心基因组SNP分析这些高利奈唑胺MIC艰难梭菌分离株之间的关系。基于遗传相关性（SNP ≤ 2），所有分离株彼此之间的差异均大于两个SNP。这种遗传异质性强烈表明，高利奈唑胺MIC艰难梭菌分离株是遗传上不同的实体，排除了在我们医疗机构内存在克隆暴发和利奈唑胺耐药艰难梭菌传播的可能性。

为了研究高利奈唑胺MIC的遗传基础，我们下载了来自不同物种的13个其他cfr基因进行比较。与其他物种相比，本研究中的菌株在cfr(B)基因上与其他物种同源性很低，除了屎肠球菌。

使用贝叶斯进化树分析来自不同物种的不同cfr基因之间的关系。来自艰难梭菌的cfr(B)基因共享一个共同祖先，并且与艰难梭菌Ox2167（登录号：NG_065840.1）和屎肠球菌（登录号：NG_050395.1）中的cfr(B)基因密切相关。因此，基于上述分析结果，我们推测艰难梭菌携带的cfr(B)基因或其环境与屎肠球菌同源，表明这些生物之间存在潜在转移。

图4显示了cfr(B)基因的遗传环境。基因组注释和比对显示，这九株高利奈唑胺MIC艰难梭菌基因组中的cfr(B)基因位于Tn6218转座子中。Tn6218结构包括int基因（转座酶/整合酶）、xis基因（切除酶）和rep基因（调节蛋白）。此外，该元件包含一个单独的开放阅读框，编码一个属于多药和有毒化合物外排家族的推定外排泵，其功能动力学值得进一步研究。本研究中大多数分离株的Tn6218与艰难梭菌Ox3196相似，而s10040802菌株与艰难梭菌Ox2167和屎肠球菌相似。这些结果揭示了在同种和不同物种之间水平传播的可能性。

讨论

这项研究首次全面表征了中国一家医院临床环境中表现出高利奈唑胺MIC的艰难梭菌菌株，特别强调了cfr(B)基因及其相关转座子Tn6218在不同利奈唑胺耐药细菌物种中的作用。我们的研究结果表明，高利奈唑胺MIC分离株通常表现出多药耐药表型，特别是对利福平和氟喹诺酮类。虽然可能存在其他耐药机制，但cfr(B)已被确定为中国临床分离株中高利奈唑胺MIC的主要决定因素。重要的是，我们的数据强调了cfr(B)通过可移动遗传元件在医疗环境中传播的潜力，强调迫切需要加强对其在肠球菌和艰难梭菌中共存的监测，以减轻耐药性传播。

我们之前的研究报告了艰难梭菌中高利奈唑胺MIC的低分离率。相比之下，墨西哥的记录率超过20%。我们的结果揭示了高利奈唑胺MIC菌株流行病学的显著地理差异，这可能源于不同地区序列型分布的差异。这与墨西哥的观察结果相似，其中ST1（NAP1/027）成为临床分离株中的主要谱系。因此，艰难梭菌ST与其携带的特定cfr基因变体之间存在显著相关性。例如，cfr(E)基因变体特异性地在ST1菌株中被识别。在本研究中，只有ST3和ST37表现出高利奈唑胺MIC表型，而其余30个ST则没有。值得注意的是，三株高利奈唑胺MIC ST3艰难梭菌菌株中有两株是非产毒的。同样，Candela等人也在非产毒艰难梭菌菌株中识别出cfr样基因。这一发现引起了人们对高利奈唑胺MIC非产毒艰难梭菌传播的担忧，因为它们被认为是人类微生物群的共生成员。在非产毒ST3菌株中识别出cfr(B)表明，这些共生菌可能充当沉默的耐药库，促使考虑在高风险临床环境中进行主动监测。特别重要的是所述基因在艰难梭菌细菌之间的可转移性，这有助于适应性进化，包括通过水平转移。

艰难梭菌的高利奈唑胺MIC临床分离株与cfr基因相关。在本研究中，所有高利奈唑胺MIC艰难梭菌都携带cfr(B)基因，这与其他报告形成对比，其他报告中高利奈唑胺MIC菌株携带cfr(E)或cfr(F)基因。此外，该研究中的大多数高利奈唑胺MIC艰难梭菌被报告为ST1，这与我们的发现不同。这可能有助于解释不同国家高利奈唑胺MIC艰难梭菌分离率的差异。此外，我们的结果显示，所有高利奈唑胺MIC菌株均对红霉素和克林霉素耐药，这与先前的观察结果一致。

负责编码23S rRNA甲基转移酶的erm(B)基因已被确定为导致红霉素和克林霉素耐药的一个因素。然而，我们发现cfr(B)位于转座子Tn6218的遗传范围内，并且超过一半的高利奈唑胺MIC艰难梭菌分离株不携带erm(B)基因。此外，其他研究报告称，cfr基因介导对 several 抗菌药物类别的耐药性，包括红霉素和克林霉素。鉴于本研究中观察到的差异现象，需要额外的证据来支持cfr导致多药耐药（包括对红霉素和克林霉素耐药）的假设。

对来自不同物种的cfr基因进行了比较分析，揭示了与其他艰难梭菌和屎肠球菌菌株中发现的基因相似，但与其它物种如金黄色葡萄球菌、解淀粉芽孢杆菌、类芽孢杆菌属物种、肉毒梭菌和松鼠葡萄球菌不同。这一发现证明了cfr基因在不同物种中的可变性。特别重要的是，cfr(B)位于Tn6218内，其结构与最初在屎肠球菌中识别的携带cfr的转座子表现出保守性。在艰难梭菌和屎肠球菌分离株之间观察到的耐药基因携带的相似性强烈表明，cfr(B)基因或其侧翼遗传背景在这些分类学上不同的生物体中具有系统发育相关性。

本研究有几个局限性应予承认。首先，虽然我们筛选了421株临床艰难梭菌分离株，但只有九株表现出升高的利奈唑胺MIC，并且cfr(B)被确定为唯一的耐药决定因素。这种相对较低的流行率仍然强调了对艰难梭菌中高利奈唑胺MIC进行持续监测的迫切需要，特别是在中国医院中以ST1/RT027菌株为目标。来自单一机构的利奈唑胺耐药分离株数量有限（n=9）可能会限制我们识别显著流行病学关联的能力，并可能影响我们关于cfr(B)分布模式的研究结果的普遍性。其次，我们没有在我们的环境中筛查利奈唑胺耐药肠球菌物种（特别是屎肠球菌），这本来可以提供有价值的证据来支持我们关于cfr(B)在艰难梭菌和肠球菌之间潜在种间传播的假设。最后，我们研究的单中心设计可能无法完全捕捉中国利奈唑胺耐药艰难梭菌菌株的全国流行病学，表明需要进行多中心调查以获得更具代表性的数据。

结论

在本研究中，我们对中国临床环境中分离的高利奈唑胺MIC艰难梭菌菌株进行了系统表征，强调了cfr(B)基因和转座子Tn6218在高利奈唑胺MIC中的关键作用。cfr(B)在临床分离株中的存在表明来自利奈唑胺使用的选择压力，值得进一步调查处方模式。此外，cfr(B)与屎肠球菌的有限同源性突出了进行更广泛测序以追踪进化起源的必要性。

伦理批准

本研究于2024年6月3日获得浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会批准（编号：IIT20240504A），并经讨论后达成计划。伦理委员会认为该方案未改变患者的治疗方案，未泄露隐私，且未造成不良后果；因此，同意被豁免。本研究遵循赫尔辛基宣言。

披露

作者报告在本工作中无利益冲突。

数据共享声明

本研究中表征的九株艰难梭菌分离株的基因组序列已提交并可在GenBank中公开获取，BioProject编号为PRJNA432876。