氧化还原节律独立于遗传时钟门控免疫诱导的细胞死亡

本研究通过利用拟南芥长周期遗传时钟突变体，揭示了氧化还原节律（redox rhythm）与遗传时钟（genetic clock）在周期长度上的差异，并首次鉴定出免疫诱导的程序性细胞死亡（PCD）作为氧化还原节律的生理输出。通过遗传和化学干预，进一步证明了氧化还原节律在控制能量密集型生理反应（如PCD）中的生物学作用，区别于遗传时钟，为理解生物钟系统的复杂调控提供了新视角。

　　

Significance

氧化还原节律是一种保守的非转录昼夜振荡，最初在无核红细胞中发现。然而，由于缺乏明确的生理输出，其生物学功能一直难以理解。通过使用拟南芥长周期遗传时钟突变体，本研究根据周期长度的差异区分了氧化还原节律和遗传时钟，并确定免疫诱导的程序性细胞死亡（PCD）是氧化还原节律的一个生理输出。通过遗传和化学扰动，进一步证明了氧化还原节律在控制能量密集型生理反应（如PCD）中的生物学作用，区别于遗传时钟。

Abstract

生物利用昼夜节律时钟来同步生理过程，以预测地球的昼夜循环并调节对环境信号的响应，从而获得竞争优势。尽管在细菌、真菌、植物和动物中已经广泛研究了不同的遗传时钟，但最近报道了一种古老的保守的昼夜氧化还原节律。然而，其生物学功能和生理输出仍然难以捉摸。本研究通过在拟南芥长周期时钟突变体中同时进行代谢和转录时间进程测量，发现了具有不同周期长度和转录靶标的氧化还原和遗传节律的共存。对靶基因的分析表明，氧化还原节律调控免疫诱导的程序性细胞死亡（PCD）。此外，这种对时间敏感的PCD被氧化还原扰动和阻断植物防御激素茉莉酸（JA）/乙烯（ET）的信号通路所消除，而在遗传时钟缺陷的背景下仍然完整。这项研究表明，与稳健的遗传时钟相比，更敏感的昼夜氧化还原节律作为调节偶然能量密集型过程（如涉及叶绿体和线粒体活性重编程的免疫诱导PCD）的信号枢纽，为生物在应激响应期间减轻代谢超负荷提供了灵活的策略。

Introduction

自古以来就观察到植物和动物的节律性日常行为。然而，昼夜节律时钟的机制基础直到20世纪才被揭示，随着第一个时钟基因的发现。这些基因编码一个由转录-翻译反馈环（TTFL）组成的内部遗传振荡器，它使生理过程/行为与昼夜环境变化同步，并“门控”（即调节强度）对生物和非生物变化的响应，以提高生物的适应性。除了遗传时钟，过氧化物氧还蛋白（PRX）在其过氧化和超氧化形式（PRX-SO_2/3）的昼夜振荡以及在一些缺乏典型TTFL电路振荡的背景中大量周期性转录本的发现，表明存在一个平行的非转录振荡器。此外，这种氧化还原节律在所有生命谱系中的保守性表明其在整个进化过程中可能的重要性。另外，虽然氧化还原节律最初是由PRX-SO_2/3的振荡决定的，但越来越明显的是，氧化还原节律远不止PRX，更好地定义为整体细胞氧化还原代谢的振荡，包括关键电子载体NAD(P)H和谷胱甘肽。然而，尽管多次尝试表征驱动氧化还原节律的振荡器，但结果尚无定论。此外，在这些突破性发现之后，对在遗传时钟缺陷突变体中观察到的振荡是由未知外部因素驱动的担忧，以及缺乏由昼夜氧化还原节律特异性调节的明确生理输出，对氧化还原振荡的自主性和重要性提出了质疑。因此，尽管遗传时钟和氧化还原节律之间的相互作用已经得到很好的建立，但昼夜氧化还原振荡的生物学功能仍然 largely unknown。

Results

The Genetic Clock and Redox Rhythm Are Disentangled in a Long-Period Clock Mutant.

阐明氧化还原节律的独特昼夜功能的困难源于，除了缺乏对其振荡机制的了解外，它与遗传时钟错综复杂地交织在一起。破坏氧化还原节律可以根据其分子结构和扰动的性质影响遗传时钟的周期、相位或振幅，反之亦然。迄今为止，遗传时钟缺陷突变体已被用于尝试识别氧化还原节律的特定转录靶标。然而，这些突变体和野生型（WT）中振荡转录本之间的 scant overlap 引发了担忧，即突变体中识别的靶标可能对WT没有功能相关性。

为了测试遗传和氧化还原节律是否可以通过另一种方法解开，我们使用了时钟基因PSEUDO-RESPONSE REGULATORs (PRRs) 7和9 (prr7 prr9) 的拟南芥突变体，其内在遗传时钟周期在12°C时约为24小时，在22°C（拟南芥生长的典型温度）时为32小时，在30°C时为36小时。因此，与WT能够在生理温度范围内维持约24小时周期不同，prr7 prr9突变体在温度补偿方面存在缺陷。prr7 prr9突变体中这种温度依赖的周期变化使其成为一个可处理的系统，可以根据振荡周期分离氧化还原和遗传节律。

我们使用氧化型（GSSG）谷胱甘肽来测量氧化还原节律的周期，原因有几个。首先，GSSG提供了谷胱甘肽氧化还原代谢总和（即氧化还原节律的一个分支）的良好近似，因为与可以从头合成的GSH不同，GSSG仅在细胞氧化还原反应中产生。不出所料，GSSG先前被显示遵循与过氧化物氧还蛋白振荡相同的氧化还原节律，这些振荡在所有生命谱系中都被检测到。其次，相对较高的谷胱甘肽丰度允许更稳健的测量。最后，与其他电子载体（如NADPH）相比，谷胱甘肽在植物中在维持细胞氧化还原稳态方面扮演更多样化的角色。虽然NADPH可以通过硫氧还蛋白-NADPH依赖性硫氧还蛋白还原酶（NTR）系统直接用于蛋白质还原，但其很大一部分用于通过谷胱甘肽还原酶（GR）将GSSG还原为GSH以减轻氧化应激。GSH不仅用于还原氧化蛋白质，还在直接清除活性氧（ROS）中起核心作用。植物中氧化还原调控的更详细概述可以在最近的综述中找到。

在样品收集之前，我们在温度和湿度控制的Percival chambers（22°C，65% RH）中在12小时光照/12小时黑暗（LD）下生长WT和prr7 prr9植物，然后在22°C或30°C下将植物释放到恒定光照（LL）条件下，以收集植物组织，用于在LL中从24小时到92小时同时进行谷胱甘肽和转录组学分析。对于转录组学测量，我们使用多重RNA退火选择连接测序（RASL-seq）方法来分析选定的约700个基因池的表达，作为RNA-seq的替代方案，以适应时间过程实验的大样本量（两种基因型，两种温度，18个时间点，22°C有6个重复，30°C有3个重复）。

时间过程数据的谐波回归分析显示，与核心遗传时钟基因LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY) 在prr7 prr9突变体中显示出比WT更长的周期相反，GSSG在prr7 prr9突变体中显示出接近WT的周期，尽管相位不同，在22°C和30°C下都是如此。因此，由GSSG代表的氧化还原节律在prr7 prr9突变体中根据周期长度与遗传时钟区分开来。值得注意的是，虽然升高的温度使prr7 prr9突变体中LHY的周期从31.71小时增加到37.34小时，重现了先前观察到的温度过度补偿，但GSSG的周期仅从27.34小时略微改变到26.57小时。因此，GSSG振荡似乎表现出温度补偿，这是昼夜节律时钟的已知标志，与遗传时钟分开。

与GSSG相反，总谷胱甘肽（GSSG + GSH）与遗传时钟一起振荡，可能是通过GLUTAMATE-CYSTEINE LIGASE (GSH1)（也称为PHYTOALEXIN DEFICIENT 2 (PAD2)）的调控。该基因编码拟南芥中谷胱甘肽生物合成限速步骤的酶，其节律模式与总谷胱甘肽的模式一致。由于总谷胱甘肽和GSSG水平是在同一样品中测量的，GSH+GSSG和GSSG振荡的分离进一步支持了氧化还原节律独立于遗传时钟。我们假设，由于GSSG仅通过氧化还原代谢产生，并且是总谷胱甘肽池中更小且更动态的部分（约2%至5%），它可能作为GSH氧化反应的“指示剂”，从而指示氧化还原节律。

遗传时钟对整体谷胱甘肽生产的调控提供了遗传时钟引导氧化还原节律的可能机制。这种相互作用也可能解释了与WT相比，prr7 prr9中GSSG相位的改变。为了检验这一假设，我们修改了先前提出的氧化还原节律的简单数学模型，引入由长周期遗传时钟驱动的谷胱甘肽振荡的周期性强迫，这导致了氧化还原节律的类似瞬态相移。

为了在植物中验证我们的发现，我们使用了谷氧还蛋白（GRX）融合的氧化还原敏感GFP（roGFP2）报告系统。roGFP2可以根据其氧化状态被两种不同波长的光激发，从而允许实时比率监测谷胱甘肽氧化还原电位。由于叶绿体是植物中还原力和能量的主要来源，我们将定位于叶绿体基质（roGFP2_chl）的roGFP2变体转化到WT和prr7 prr9突变体中，以监测活植物中的氧化还原节律。我们使用定制的荧光成像室在30°C的LL下进行还原和氧化roGFP2_chl的延时测量，这是遗传时钟和氧化还原节律周期存在较大分离的温度。我们使用了用2种不同波长激发后的roGFP2荧光的归一化比率。我们检测到荧光比率的稳健振荡，表明roGFP2作为体内氧化还原节律读出的可行性。使用Biodare的FFT-NLLS算法对个体轨迹的分析证实，与GSSG数据一致，prr7 prr9中的roGFP2比率以接近24小时的周期振荡，而不是预期的约36小时的遗传时钟周期。在GSSG测量中也观察到类似的相位差，进一步表明这些振荡是内源的，并代表由GSSG测量的氧化还原节律。

Transcriptional Targets of the Redox Rhythm Are Distinct from Those of the Genetic Clock Based on Periods.

氧化还原节律和遗传时钟在prr7 prr9突变体中的不同振荡周期为通过聚类识别它们的特定转录靶标提供了机会。我们设计了一个两步策略来识别由氧化还原节律驱动的振荡基因。由于我们不仅对靶基因的周期长度感兴趣，而且对它们在赋予特定生理功能中的共表达感兴趣，我们首先根据它们在prr7 prr9突变体22°C下的昼夜时间过程RASL-seq数据中的归一化时间特征，使用k均值聚类对转录本进行聚类。在测试了不同的k值后，我们选择k=16以适应所有可能的聚类，用于以大约32小时的遗传时钟周期振荡的基因（每个可能相位由4小时的时间分辨率给出的8个点，乘以2以考虑正负偏斜）。对于使用prr7 prr9在22°C数据定义的每个共表达聚类中的基因，第二步是使用CosinorPY包识别在WT和prr7 prr9突变体在22°C和30°C下具有统计学显著振荡（P < 0.05）的节律性转录本。虽然在WT 22°C下所有共表达聚类中观察到接近24小时的周期，但在prr7 prr9突变体中发现了更大的周期长度变化，大多数基因聚类以预期的约32小时的遗传时钟周期振荡。有趣的是，聚类2和6（C2和C6）主要包含周期接近WT的振荡基因。由于k均值聚类的输出可能因初始种子和聚类数量而异，我们还使用确定性层次算法分析了RASL-seq数据，这在很大程度上重现了k均值聚类的结果。

为了排除观察到的prr7 prr9中昼夜基因的周期长度分离是由组织特异性引起的可能性，我们通过将具有已知组织特异性的基因与那些没有的基因分组，对使用均质化叶组织生成的RASL-seq数据进行了进一步分析，发现C2和C6基因并非源自单一组织，并且仍然通过其明显更短的周期与所有组中的其他基因分离，表明C2和C6的周期分离不太可能是由于组织特异性效应。我们还检查了两个遗传时钟驱动的基因CHLOROPHYLL A/B-BINDING PROTEIN 2 (CAB2) 和CATALASE 3 (CAT3)，据报道它们在WT中具有约2小时的周期长度差异，并发现这种差异在prr7 prr9中持续存在，但两个周期都>32小时，与C2和C6中的基因不同。最后，我们使用了另一个包MetaCycle，通过结合两种额外算法JTK_CYCLE和Lomb-Scargle周期图独立验证我们从CosinorPY分析得到的结果。在分析了具有统计学显著性的振荡（P < 0.05）后，我们再次发现C2和C6在prr7 prr9突变体中以较短的周期振荡。值得注意的是，在prr7 prr9中，C2和C6中基因的振荡也显示出与WT在22°C下相比改变的相位，类似于GSSG的相位，与这些基因受氧化还原节律调控一致。

令人惊讶的是，在30°C下，C2和C6中几乎没有基因保持较短的周期。在这个升高的温度下，这些基因似乎由遗传时钟驱动。因此，C2和C6基因可以同时受到氧化还原节律和遗传时钟的调控，氧化还原节律在正常温度下起主要作用，而遗传时钟在升高温度下占主导地位。在我们研究的RASL-seq基因中，来自C13的单个基因，关键开花时间调节因子FLOWERING LOCUS T (FT)，在两种温度下都可靠地以较短的周期振荡，与在prr7 prr9突变体中观察到的接近WT氧化还原节律周期一致。这些结果暗示，在30°C下，虽然C2和C6基因与氧化还原节律解耦，但FT，以及可能我们RASL-seq基因池中未存在的其他开花时间基因，仍然在昼夜氧化还原节律调控下，可能通过不同的信号通路。

由于时间过程实验可能由于低时间分辨率和植物样品变异导致周期估计不准确，我们接下来构建了生物发光报告系来验证我们的发现。基于以前的出版物，我们选择遗传时钟的早晨相位输出基因CATALASE 2 (CAT2) 的启动子来驱动荧光素酶报告基因。为了制作氧化还原节律输出的报告基因，我们从C6中选择了S-NITROSOGLUTATHIONE REDUCTASE 1 (GSNOR1) 的启动子，它是植物中S-亚硝基硫醇（SNO）水平的关键调节因子。除了在我们的RASL-seq数据中检测到其稳健振荡外，GSNOR1活性对NADH和GSH的依赖进一步将该基因与氧化还原节律联系起来。将CAT2p:LUC和GSNOR1p:LUC构建体转化到WT和prr7 prr9背景中，并对所有独立的T1系进行成像以最小化插入位置效应。由于叶龄可能影响同一植物内昼夜节律时钟的周期，并且为了避免报道的组织特异性效应，我们量化了茎尖的发光，其昼夜节律稳健且高度同步。然后比较所有节律系（相对振幅误差（RAE）小于或等于0.7）在三个独立实验中的周期长度。与RASL-seq数据一致，在prr7 prr9中检测到CAT2p:LUC和GSNOR1p:LUC振荡周期长度的显著差异，但在WT 22°C下没有。有趣的是，对于最后一个振荡周期，GSNOR1p:LUC振荡周期似乎延长以匹配CAT2p:LUC振荡。这可能是由于通过GSH1的节律性转录，氧化还原节律被遗传时钟引导。为了支持这一假设，我们在数学模型的后期时间点重现了类似的结果，表明在prr7 prr9突变体中氧化还原节律和遗传时钟之间的周期分离是瞬态的。为了确定周期分离不仅限于这对基因，我们测试了另一对报告基因。选择CATALASE 3 (CAT3) 作为傍晚相位的遗传时钟输出，以确保早晨和傍晚相位的遗传时钟输出都与氧化还原节律分离。对于氧化还原节律，选择编码来自氧化磷酸戊糖途径（PPP）的酶的GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHYDROGENASE 6 (G6PD6) 基因，因为PPP是哺乳动物中氧化还原节律和遗传时钟相互作用的枢纽，并且G6PD6基因代表不同的氧化还原调节基因簇（C2）。与前一报告基因对一样，我们发现G6PD6p:LUC在prr7 prr9中以明显短于CAT3p:LUC的周期振荡，但在WT中没有。因此，我们基于其输出基因的不同周期，在同一组织类型（茎尖分生组织）内观察到了氧化还原和遗传昼夜节律的共存，进一步证实了来自RASL-seq、谷胱甘肽和roGFP2测量的结果。

Redox Rhythm Regulates Immune-Induced Programmed Cell Death.

为了测试具有相似时间模式（即聚类）的基因是否具有共同的生物学功能，进行了基因本体（GO）富集分析，使用RASL-seq探针集作为背景，以消除使用有限基因池带来的偏差。值得注意的是，即使在这个主要包含参与不同免疫反应的基因的探针集中，发现C2基因显著富集了那些参与免疫和细胞死亡调节（主要是免疫诱导的PCD，在植物中称为过敏反应）的基因，而C6由于聚类中基因数量少可能没有显著富集。其他具有显著GO术语富集的聚类具有光合作用（C3）、生长（C4）和信使RNA（mRNA）加工（C14）相关基因。当将氧化还原节律靶基因（C2和C6）合并进行GO富集分析时，再次发现了免疫相关的GO术语，与单独的C2相似，尽管细胞死亡成为顶级GO术语。进一步的STRING（搜索工具用于检索相互作用基因/蛋白质）分析发现了一个高度互连的网络，其中已知的免疫诱导细胞死亡调节基因，如SUPPRESSOR OF BIR1-1 (SOBIR1)、PHYTOALEXIN DEFICIENT 4 (PAD4) 和ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1 (EDS1) 处于枢纽位置。此外，与基于时间表达特征的聚类分析一致，STRING根据其公开可用数据检测到聚类2和6中基因的高度共表达。此外，仅对那些显示统计学显著振荡（P < 0.05）的基因进行分析，产生了类似的结果。基于C2和C6基因的身份，我们假设昼夜氧化还原节律在效应器触发免疫（ETI）期间调节PCD，当病原体效应器的存在被其同源核苷酸结合位点、富含亮氨酸重复序列（NB-LRR）受体在植物宿主中识别时发生。这种免疫反应已知与ROS爆发和ATP水平的显著增加有关。还已知谷胱甘肽耗竭严重损害PCD。此外，虽然先前报道了ETI触发PCD的时间敏感性，但没有提出这种调节的机制。值得注意的是，与C2和C6基因在30°C下与氧化还原节律解耦一致，ETI介导的PCD众所周知在升高温度下被抑制。

为了测试氧化还原节律对PCD的昼夜控制，我们使用携带效应器基因avrRpt2的细菌病原体Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326/avrRpt2) 感染WT、遗传时钟缺陷的CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 过表达 (CCA1ox) 系和缺乏avrRpt2的NB-LRR受体的突变体resistant to p. syringae 2 (rps2)。基于先前的一项研究，该研究显示在恒定光照（LL）下连续两个昼夜周期，ETI诱导的PCD在WT中向早晨昼夜门控，我们通过在恒定光照（LL）下生长2天后在主观早晨和主观傍晚进行ETI诱导的细胞死亡测定，检查了这种时间调节的存在或 absence，以消除CCA1ox中的瞬态振荡。与我们的假设一致，WT和CCA1ox在主观早晨都显示出比主观傍晚更强的ETI相关PCD，尽管先前报道CCA1ox在没有avrRpt2效应器的情况下对细菌病原体的时间敏感性基础抗性受损。与遗传时钟缺陷的CCA1ox相反，6-PHOSPHOGLUCONOLACTONASE 3 (PGL3) 的突变体，编码质体PPP氧化部分的关键酶，其谷胱甘肽水平显著改变并具有组成性增强的抗性，其PCD减少并失去了对ETI诱导的时间敏感性。这一结果与在无核人红细胞中需要功能性PPP来维持氧化还原节律的发现一致。由于pgl3增强的基础抗性表型依赖于组成性激活的NONEXPRESSOR OF PATHOGENESIS-RELATED GENES 1 (NPR1)，其核转位对氧化还原节律敏感，我们还测试了npr1单突变体和pgl3 npr1双突变体的ETI诱导PCD。我们发现npr1单突变体仍然对免疫触发PCD具有时间敏感性，但当与pgl3结合时，无法挽救pgl3的PCD表型，表明pgl3中缺乏昼夜PCD不是由于NPR1介导的抗性的组成性激活。最后，我们使用toc1 lhy cca1核心时钟基因三重突变体作为替代的遗传时钟缺陷突变体，和使用GSH1的pad2突变体作为替代的氧化还原突变体。我们观察到toc1 lhy cca1仍然表现出显著的时间PCD水平差异，与pad2相反，进一步证实了昼夜PCD是由氧化还原节律驱动的，而不是遗传时钟。

Redox Rhythm Regulates PCD through the Jasmonic Acid (JA)/Ethylene (ET) Defense Pathway.

NPR1先前已被显示参与水杨酸（SA）介导的ETI诱导PCD抑制，并通过增加遗传时钟的振幅来门控SA靶基因表达。然而，在npr1突变体中观察到的PCD的昼夜门控表明，这种氧化还原节律介导的现象是通过SA/NPR1非依赖途径。已知除了SA，其他防御激素，如JA和ET，也有助于ETI。在氧化还原节律调节的靶基因中，C2中的EDS1和PAD4都是ETI期间SA和JA串扰的关键调节因子，尽管它们不是本研究中使用的卷曲螺旋（CC）类NB-LRR功能所必需的。此外，C2和C6还包括JA和ET介导的免疫反应的调节因子。C6中的GSNOR1已知既调节PCD又促进烟草中JA诱导的防御对抗食草动物。C2中的SOBIR1和RECEPTOR LIKE PROTEINs (RLPs) 参与PCD和JA/ET介导的防御对抗坏死性真菌。这些发现表明，昼夜氧化还原节律可能通过JA和/或ET防御途径调节PCD。

JA防御途径通常被JASMONATE-ZIM-DOMAIN PROTEIN (JAZ) 蛋白抑制，这些蛋白在ETI期间被降解。在JAZ下游，JA途径包含两个相互拮抗的分支：仅JA分支，以MYC2作为核心转录因子（TF）促进对抗食草动物的防御，和JA/ET共享分支，以ETHYLENE-INSENSITIVE3 (EIN3) 和ETHYLENE-INSENSITIVE3-LIKE 1 (EIL1) 作为关键TF保护对抗坏死性病原体。为了确定哪个JA信号分支参与PCD的昼夜控制，我们使用不可诱导的jaz1Δjas突变体表达缺乏Jas降解结构域的JAZ1蛋白，以及关键TF突变体myc2和ein3 eil1来评估在用Psm ES4326/avrRpt2浸润后的PCD。我们发现，虽然jaz1Δjas和ein3 eil1突变体都失去了对ETI触发PCD的时间敏感性，但myc2保留了它，表明完整的JA/ET分支对于ETI相关PCD的昼夜调节是必要的。当比较在LL下第2天主观傍晚和第3天主观早晨感染后的PCD水平时，WT和ein3 eil1获得了类似的结果，表明是昼夜氧化还原节律，而不是长时间暴露于恒定光照，负责这种调节。

为了进一步证明氧化还原节律在PCD昼夜调节中的作用，我们使用细胞可渗透的GSH衍生物，谷胱甘肽单乙酯（GSHmee），来扰动细胞氧化还原节律。GSHmee处理先前已被显示通过NPR1的活性破坏氧化还原节律同时加强遗传时钟。为了排除GSHmee对病原体生长的可能影响，我们使用响应地塞米松（dex）处理表达细菌效应器avrRpt2的转基因植物来诱导PCD。我们发现，虽然在主观早晨的处理比在主观傍晚触发更强的PCD，但与GSHmee共同处理消除了这种差异。这进一步将细胞谷胱甘肽水平与ETI诱导PCD的时间敏感性联系起来。

最后，我们使用roGFP2_chl以及定位于细胞质（roGFP2_cyt）和线粒体基质（roGFP2_mt）的额外roGFP2变体来评估亚细胞区室特异性氧化还原对ETI介导PCD的贡献。整株延时成像和随后的共聚焦显微镜显示，在ETI诱导后，叶绿体和线粒体首先在“启动阶段”变得强烈还原，而细胞质氧化还原与模拟相比保持不变，尽管ETI信号传导与通过质膜相关NADPH氧化酶活性产生的ROS有关。然而，在PCD发作之前（“发作阶段”），我们观察到叶绿体和细胞质转向更氧化状态，但线粒体没有。这一观察与最近提出的假设一致，即在ETI期间，叶绿体基质首先由于通过自噬去除RuBisCO而过度还原，这最终有助于触发ROS的产生，使叶绿体成为ETI诱导PCD期间细胞氧化的主要来源。

Discussion

近年来，越来越多的证据表明，各种自主振荡器与典型的生物振荡系统共存。例如，中央Cyclin/Cyclin依赖性激酶振荡器最近被显示相位锁定一个自主子振荡器以协调细胞器生物发生。然而，氧化还原节律的生理输出，因此其生物学意义，在其首次发现后的十多年里仍然难以捉摸。我们的研究 firmly establishes ETI触发PCD作为一个生物过程， specifically regulated by the circadian redox rhythm through the JA/ET defense signaling pathway and demonstrates its biological significance in regulating plant cell fate upon pathogen challenge. 这种PCD的昼夜控制区别于遗传时钟调节的通过防御激素SA和信号蛋白NPR1促进细胞存活以响应病原体挑战的抗微生物基因表达。尽管它们在调节不同植物免疫反应中具有可区分的作用，氧化还原节律和遗传时钟通过蛋白质（如NPR1响应氧化还原扰动通过增强遗传时钟的振幅）的活动 intrinsically intertwined。在相反方向，遗传时钟通过转录基因（如GSH1）控制氧化还原分子（如谷胱甘肽）的生产。使用长周期突变体prr7 prr9允许我们解开两个振荡系统，至少在LL下是瞬态的。prr7 prr9中这两个振荡之间的这种动态相互作用可以解释与WT相比突变体中GSSG的相移以及氧化还原节律可能被遗传时钟