细胞毒性NK细胞通过CX3CR1介导的免疫排斥表型抑制黑色素瘤对检查点免疫疗法的响应

本研究发现免疫检查点阻断（ICB）治疗中，细胞毒性NK细胞通过CX3CR1依赖性机制被招募至肿瘤外围，抑制CD8+ T细胞浸润与功能，导致免疫排斥表型及ICB耐药；靶向NK细胞（如抗CD38抗体）可逆转该耐药，为半数ICB无应答患者提供新治疗策略。

　　

摘要

免疫检查点阻断（ICB）疗法虽革新了癌症治疗，但约半数患者因淋巴细胞无法浸润肿瘤巢（称为免疫排斥）而对ICB无应答。本研究通过分析接受ICB治疗的黑色素瘤患者匹配治疗前和早期治疗中活检样本的免疫景观，发现无应答者早期治疗中活检的细胞毒性NK细胞显著增加。空间多组学分析揭示，在应答病灶中，NK细胞与CD8⁺ T细胞在肿瘤床内共定位，而在无应答病灶中，NK细胞被排斥于肿瘤实质外。值得注意的是，在具有免疫排斥表型的独特黑色素瘤小鼠模型中，药理学耗竭NK细胞可释放肿瘤核心的免疫浸润并在ICB暴露后清除肿瘤。机制上，NK细胞通过趋化因子受体CX3CR1被主动招募至ICB暴露后的免疫排斥区域，以抑制CD8⁺ T细胞的肿瘤浸润和抗肿瘤功能。

引言

尽管ICB取得临床成功，约半数转移性黑色素瘤患者无应答。需预测应答的生物标志物，且理解耐药机制是提高治疗成功的关键。免疫排斥，即淋巴细胞无法浸润肿瘤，常预测ICB耐药，但其机制仍不清楚。NK细胞作为抗肿瘤免疫应答的关键效应器，近期研究挑战此范式。肿瘤相关CD69⁺ perforin^– NK细胞在ICB难治性肿瘤中吸引髓源性抑制细胞。此外，NKp30⁺ NK细胞在非应答ICB患者中促进B7H6⁺活化T细胞的裂解，而肿瘤浸润功能障碍CD56^dimCD16^hi NK细胞（高表达NR4A1和抑制性受体，低表达细胞毒性颗粒）与免疫治疗耐药相关。这些发现表明NK细胞可能呈现多种表型并在影响ICB应答中扮演复杂角色，但其是否直接贡献治疗耐药及在何种特定背景下发生尚待阐明。

多数黑色素瘤研究使用对其他治疗耐药患者的样本，而ICB现为一线治疗。此外，这些研究常分析ICB治疗前或不一致晚期阶段的活检。这很不幸，因新兴证据表明治疗早期所取样本可能比治疗前活检更具预测性。而且，尽管实体瘤中免疫细胞拓扑是免疫治疗应答的关键预测因子，多数研究至今在解离肿瘤样本上进行，因此缺乏空间背景。我们推测对初治黑色素瘤患者ICB治疗前和期间活检的单细胞空间分析可揭示耐药机制并指导联合疗法或生物标志物开发。

结果

剖析黑色素瘤生态系统的免疫区室

活检（皮肤/ cutaneous, n = 12; 皮下, n = 8; 淋巴结, n = 26）从初治（III–IV期）转移性黑色素瘤患者队列（SPECIAL试验, #S62275）收集于治疗前（BT）和早期（± 2–3周）治疗中（OT）。这些患者接受抗PD-1（αPD-1）单药（nivolumab或pembrolizumab, n = 17）或αPD-1联合抗CTLA4（αCTLA4; ipilimumab + nivolumab, n = 6）。从23患者共获20匹配活检。患者临床特征基线获取，ICB应答使用RECIST v1.1标准OT3月评估（Supplementary Table S1A）。新鲜组织处理用于单细胞RNA测序（scRNA-seq），固定材料用于病理评估和空间多组学分析（图1A）。从所有患者收集外周血样本并用于流式细胞术（FACS）免疫表型分析。

质量控制和数据标准化整合后，基于高免疫基因集活性和低平均拷贝数变异评分识别25,401个单免疫细胞。一个样本因含少于10个免疫细胞而丢弃。无监督Louvain聚类识别17个免疫细胞簇，基于既往发表细胞类型特异性基因特征注释，结果10个主要免疫细胞类型。这些包括CD8⁺和CD4⁺ T细胞、调节性T细胞、CD8⁺ T细胞/NK细胞、B细胞、浆细胞、髓系细胞、肥大细胞和浆细胞样树突细胞（pDC; Supplementary Fig. S1A and S1B; Supplementary Table S2）。我们识别一小群细胞高表达色素生产基因（MLANA和PMEL）和细胞外囊泡形成相关基因（如CD63和TIMP3; Supplementary Table S2）。这些细胞主要在皮肤活检中检测到并注释为黑素细胞。注意黑素细胞表达若干先天免疫基因，这解释为何它们未被过滤掉。

CD8⁺ T细胞/NK细胞和髓系细胞簇细胞进一步亚聚类。在CD8⁺ T细胞/NK细胞簇中，55%细胞CD8A阳性，而92%细胞表达GNLY，提示细胞毒性T细胞和细胞毒性NK细胞居于此簇（Supplementary Table S2）。因此我们重新聚类所有CD8⁺ T细胞簇，从而检索到一独立NK细胞簇，以高表达KLRF1、TYROBP、TRDC、NCAM1（CD56）、NCR1和NKG7及低表达CD8A、CD4和CD3E为特征（图1B和C; Supplementary Table S3）。此簇细胞显示细胞毒性表型，高表达GNLY、GZMB和PRF1，排除与其他先天淋巴样细胞群重叠。CD8⁺ T细胞细分为记忆（IL7R、FOS、TCF7和SELL）、活化（IFNG、CCL3和CCL4）、细胞毒性（GNLY、GZMB和PRF1）和功能障碍（表达较高水平CXCL13、LAG3和CTLA4及较低水平细胞毒性基因和IFNG）。

由于单核吞噬系统成员显示转录相似性，我们重新聚类髓系和pDC簇一起，结果五个亚簇：巨噬细胞C1Q、巨噬细胞SPP1、单核细胞、树突细胞（DC）和pDCs（Supplementary Fig. S1C; Supplementary Table S4）。但巨噬细胞C1Q簇含表达抗炎（C1Q、APOE和MRC1）和促炎角色（CLXL9和HLA基因）相关基因细胞。我们重新聚类这些细胞为五个亚簇：巨噬细胞LYVE1、巨噬细胞CXCL9、巨噬细胞PLAG2D、巨噬细胞CCL3和黑素巨噬细胞（Supplementary Fig. S1D; Supplementary Table S5）。巨噬细胞LYVE1簇很大程度上与已知血管周M2样表型重叠，表达血管生长因子涉及血管生成（CD209、LILRB5和PDGFC）和M2极化相关基因（CD163、CSF1R和MRC1; Supplementary Table S5）。巨噬细胞CXCL9和巨噬细胞CCL3基因特征与M1样巨噬细胞特征重叠。注意而非与常规M1和M2标志物相关，肿瘤相关巨噬细胞极性与CXCL9和CXCL10 versus SPP1 divergent表达相关。巨噬细胞_CCL3簇以促炎细胞因子（CCL3、CCL4、CXCL3和TNF）和转录因子（FOS、JUN、ATF3和NFKB基因）关联巨噬细胞活化为特征（Supplementary Table S5）。

因其已知表型相似性，我们也重新聚类单核细胞和DCs一起。我们识别簇对应经典单核细胞（单核细胞CD14）、非经典单核细胞（单核细胞CD16）、中间单核细胞（单核细胞_TNFSF13）、常规1型DCs和常规2型DCs（Supplementary Fig. S1E; Supplementary Table S6）。

总共，我们识别22种不同免疫细胞类型（图1D, Supplementary Fig. S1F; Supplementary Table S7）。如预期，某些这些细胞群频率依其组织来源变化（Supplementary Fig. S2A and S2B）。例如，B细胞和髓系细胞在淋巴结活检和皮肤转移中最突出。重要地，不同组织活检均匀分布跨治疗结局（χ2检验P值 = 0.7; Supplementary Fig. S2C）。

NK细胞丰度与ICB内在耐药相关

如预期，活化、记忆和功能障碍CD8⁺ T细胞在应答者（R）病灶中比无应答者（NR）更丰富（图1E）。出乎意料地，NK细胞丰度在NRs OT病灶中显著高于应答者而其他免疫细胞无此关联（Supplementary Fig. S3A）。此观察在公开数据集中复现，包括：scRNA-seq数据集48活检收集治疗前后（间22和867天）从转移性黑色素瘤患者暴露αPD-1疗法。与我们数据一致，NK细胞显著增加在OT病灶从NRs对比应答者[Supplementary Fig. S3B（左）]。此外，我们利用批量RNA测序数据集从转移性黑色素瘤队列处理αPD-1疗法并去卷积数据使用CIBERSORTx。再次，NK细胞相对丰度在（± 3–4周）OT样本中显著更高在NRs[Supplementary Fig. S3B（中）]。 notably，类似关联观察在scRNA-seq数据集乳腺癌患者处理αPD-1且样本收集2至3周OT。此研究中，两群NK细胞识别：NK_Cyto（对比OT转移性黑色素瘤病灶从NRs，表达GNLY、CXC3R1和FCGR3A）和NK_Rest（表达XCL1和XCL2）。与我们发现在黑色素瘤一致，NK_Cyto百分比而非NK_Rest与无克隆型T细胞扩展趋势相关[Supplementary Fig. S3B（右）]。

三突出NK细胞亚群近期描述于健康组织：NK1、NK2和NK3。多数NK细胞富集在NR OT转移性黑色素瘤样本相关细胞毒性样NK1亚群且最相似于NK效应状态（组3）和c7-NR4A3群体描述于两近期泛癌研究（图1F）。相反，某些NK细胞在OT病灶从应答者表达XCL1、XCL2（～50%, P = 0.12和P = 0.00042, Wilcoxon检验）和IFNG（～25%, P = 0.34, Wilcoxon检验; 图1F）且最相似于NK2细胞和NK应激（组1）和典型（组2）。此NK细胞群展示免疫调节和细胞因子生产能力。 chemokines/cytokines与NK细胞毒性基因评分比率确认NK细胞从NRs展示细胞毒性而非chemokine生产表型（图1G）。

若干NK细胞群与免疫治疗耐药相关。但NK细胞在我们黑色素瘤队列显著不同于那些细胞。少数细胞表达NCR3，且表达水平非常低，不像NKp30群体描述由Kilian和同事（图1F）。这些细胞也清晰不同于肿瘤相关CD69⁺IFNG⁺PRF1^–和功能障碍/低细胞毒性NR4A1⁺ CD158a（KIR2DL1）⁺ CD158e（KIR3DL1）⁺ NK细胞群描述于其他研究（图1F）。

流式细胞术未揭示总外周血NK细胞（PBNK）百分比差异，定义为CD19^? CD14^?CD123^?CD3^?CD56⁺细胞（Supplementary Fig. S4A），跨时间点和ICB结局（Supplementary Fig. S4B）。 Notably，然而，我们观察GZMB⁺和PRF1⁺ PBNKs分数下降 upon ICB暴露在NRs（但非应答者; Supplementary Fig. S4C）。这些数据可能指示这些细胞主动招募从血液至NR，但非应答者，病灶 during治疗。

这些数据提示效应器/细胞毒性NK细胞群富集，可能通过主动招募，在ICB难治性病灶。

细胞毒性NK细胞未能浸润肿瘤床在NR病灶

不意外，各种CD8⁺ T亚群丰度和其他免疫细胞显著关联“brisk”浸润模式（图2A; Supplementary Fig. S5A）。相反，NK细胞最多在活检展示“non-brisk”（免疫排斥）表型，占约50%所有NR样本。多数剩余NR样本显示缺失/荒漠表型。

为确定NK细胞空间分布，我们执行多重免疫荧光在17 NR样本和11应答者样本，表型个体细胞用免疫、黑色素瘤和基质标志物（n = 40; Supplementary Table S8）。引导由我们scRNA-seq数据，显示GNLY仅表达在NK和细胞毒性CD8⁺ T细胞，NK细胞识别为CD45⁺CD3^?和GNLY⁺细胞（图2B）。关键地，NK细胞主要定位在非肿瘤和肿瘤周区域在NR病灶，尤其在OT样本。相反，NK细胞均匀分布在应答者在两时间点（图2C）。类似观察为CD8⁺ T细胞（Supplementary Fig. S5B）。视觉检查确认NK细胞与CD8⁺ T细胞共定位在肿瘤边缘在NR病灶（图2C; Supplementary Fig. S5C）。在应答者，NK细胞部分密集免疫浸润包围和散布黑色素瘤细胞或简单未检测到。

为进一步探索NK细胞定位和表型在NR病灶，我们监测360 RNA标志物表达（Supplementary Table S9）使用高plex原位空间转录组学在匹配BT和OT活检（n = 4）和额外OT样本（n = 4）。Leiden聚类识别各种细胞类型/状态，包括NK细胞[Supplementary Fig. S6A（左）]。我们确认多数NK细胞表达高水平GNLY、PRF1和GZMB[Supplementary Fig. S6A（右）]。XCL1、XCL2、IFNG、NCAM1、CD69和CCL3仅表达在少数NK细胞且低水平， thus确认细胞毒性身份多数NK细胞在NR样本。多数OT样本（五 of六）拥有免疫排斥表型[图2D; Supplementary Fig. S6B（左）]。在这些样本，所有NK细胞被排斥从肿瘤区域和共定位与CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、DCs和B细胞 either outside肿瘤实质和/或包围血管在区域缺乏黑色素瘤细胞。一BT样本也拥有免疫排斥表型[Supplementary Fig. S6C（左）]和一拥有冷表型[Supplementary Fig. S6C（右）]。

细胞毒性基因表达（如GNLY、GZMB和PRF1）富集在排斥OT样本，和XCL1和XCL2富集在BT样本（图2E）。邻域分析确认NK细胞共定位与CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、DCs和B细胞，最显著在排斥OT样本（图2F; Supplementary Fig. S6D）。有趣地，当检查身份20免疫细胞最接近NK细胞，我们发现CD4⁺ T细胞和DCs在BT样本和CD8⁺ T细胞在OT样本（图2G）。

这些数据指示细胞毒性NK细胞积累 outside肿瘤区域在ICB暴露病灶从难治患者展示免疫排斥表型。

NK细胞消融诱导ICB应答在黑色素瘤小鼠模型展示免疫排斥表型

为确定NK细胞是否扮演 causative角色在ICB耐药在病灶具免疫排斥表型，我们处理小鼠携带 either免疫排斥NRAS;Ink4a肿瘤或免疫浸润YUMM5.2肿瘤（图3A–C; Supplementary Fig. S7A）与αPD-1和/或抗NK1.1（aNK1.1）抗体以耗竭NK细胞（图3D）。虽然αPD-1单药减少生长YUMM5.2同种移植黑色素瘤病灶，此治疗仅边际影响NRAS;Ink4a肿瘤（图3E）。NK细胞耗竭在免疫浸润YUMM5.2模型废除敏感性 to ICB， whereas它 drastic敏化NRAS;Ink4a模型 to αPD-1疗法（图3E）。组织病理学分析揭示治疗与 either aNK1.1或αPD-1单药不影响肿瘤区室完整性在此模型[Supplementary Fig. S7B（底行）]。虽然αPD-1导致中度（虽不显著）增加CD45⁺肿瘤浸润，aNK1.1未引起任何改变在免疫浸润模式[图3F; Supplementary Fig. S7C（右）]。这些抗体组合，然而，结果 massive增加免疫细胞浸润和肿瘤破坏。此 sharp对比观察在YUMM5.2模型和在YUMM1.7，另一免疫浸润模型（Supplementary Fig. S8A and S8B）。 thus，NK细胞增强ICB功效在黑色素瘤具免疫浸润表型但阻碍功效在病灶具免疫排斥表型。 Remarkably，在伴随文章，类似发现报告在免疫排斥模型结肠腺癌（MC38）。

NK细胞损害CD8⁺ T细胞抗肿瘤功能在免疫排斥黑色素瘤

为获得洞察机制 underlying NK介导耐药 to ICB，我们分析细胞组成NRAS;Ink4a和YUMM5.2黑色素瘤跨队列通过scRNA-seq（Supplementary Fig. S9A and S9B; Supplementary Table S10）。相似观察在人类活检从NR患者，αPD-1引起增加NK细胞丰度在NRAS;Ink4a病灶。相反，相同治疗导致减少NK细胞在YUMM5.2肿瘤。CD8⁺ T细胞增加在NRAS;Ink4a病灶 upon NK细胞耗竭，且此恶化 upon αPD-1和aNK1.1联合暴露（图3G; Supplementary Fig. S9C）。此观察提示在NRAS;Ink4a免疫排斥肿瘤，NK细胞损害扩展CD8⁺ T细胞区室。重要地，NK细胞耗竭也导致积累CD8⁺ T细胞在MC38模型（见伴随文章）。

在NRAS;Ink4a模型，CD8⁺ T细胞聚类 outside肿瘤区域（Supplementary Fig. S9C and S9D）。暴露 to aNK1.1未改变此模式，和治疗与αPD-1轻微增加CD8⁺ T细胞浸润。相反，联合治疗结果 dramatic招募CD8⁺ T细胞 within肿瘤床。这些结果建立角色为NK细胞在维持免疫排斥表型在病灶暴露ICB。

我们接下来移植NRAS;Ink4a细胞在小鼠缺乏CD8⁺ T细胞（Supplementary Fig. S9E）。虽然NK细胞耗竭联合αPD-1治疗诱导 drastic抗肿瘤应答在对照小鼠，此抗肿瘤效应完全废除在CD8⁺ T细胞缺陷小鼠（图3H）。此实验提供直接证据为功能互动 between NK和CD8⁺ T细胞在免疫排斥病灶。

靶向CX3CR1依赖性NK细胞招募恢复免疫治疗有效性

我们识别两主要NK细胞亚聚类在黑色素瘤小鼠病灶暴露ICB[图4A（左）]。一簇，富集在YUMM5.2和特征高表达水平Xcl1，紧密相似于NK细胞检测在人类应答者活检。第二簇（富集在NRAS;Ink4a模型）表达高水平Prf1和Gzma，相似于细胞毒性NK细胞识别在NR病灶，且 drastic增加 upon αPD-1疗法（图4A和B）。

进一步表型NK细胞群NRAS;Ink4a模型使用Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing（CITE-seq; 簇11; Supplementary Fig. S10A; Supplementary Table S11）揭示αPD-1引起增加CX3CR1蛋白表达和减少CD62L，整合素（CD49b和CD11a），CD54（Icam1）和CD90.2（Thy1; 图4C），提示αPD-1促进主动招募NK细胞至这些病灶。我们也观察上调CD355（Nkp46）和CXCR1，指示NK细胞成熟 under ICB疗法。 Likewise，αPD-1诱导积累成熟（CD62L^–）和细胞毒性（CD69⁺GZMB⁺）NK细胞在MC38结肠癌模型（Supplementary Fig. S10B）。

我们处理NRAS;Ink4a携带小鼠与化学抑制剂CX3CR1，JMS-17-2。虽然JMS-17-2未显著改变体内生长动力学这些肿瘤，组合与αPD-1导致 dramatic抑制肿瘤生长（图4D; Supplementary Fig. S10C）。 Consistently，我们观察显著减少NK细胞丰度在肿瘤边缘和增加浸润CD45⁺免疫细胞（包括CD8⁺ T细胞） upon暴露 to αPD-1和JMS-17-2组合（图4E; Supplementary Fig. S10D）。这些数据指示NK细胞招募诱导由ICB是依赖性 on CX3CR1和 highlight关键贡献此招募 to免疫排斥和ICB无应答。

临床兼容方法减轻治疗耐药在肿瘤具免疫排斥表型

Daratumumab，单克隆抗体定向对抗CD38，批准用于治疗患者多发性骨髓瘤。长期治疗与daratumumab引起增加风险感染由于耗竭PBNKs。有趣地，CD38靶向未显著改变体内生长NRAS;Ink4a病灶，但组合抗CD38（αCD38）/αPD-1显著减少肿瘤生长（图4D）。此伴随诱导瘤内坏死（Supplementary Fig. S10C），显著减少NK细胞丰度在肿瘤边缘和增加CD8⁺ T细胞肿瘤浸润（图4E; Supplementary Fig. S10D）。 Notably，αCD38暴露也减少瘤内巨噬细胞丰度（Supplementary Fig. S10D）。此可能引起由于耗竭一群巨噬细胞表达CD38存在这些病灶（簇2, Supplementary Fig. S10A; Supplementary Table S11）和/或次要 to增加CD8⁺ T细胞肿瘤丰度。 Nevertheless，这些发现呈现一方法 address ICB therapy耐药在肿瘤具免疫排斥表型 that can快速实施在临床设置。

讨论

本研究表征免疫景观初治黑色素瘤在超过20患者及其应答免疫治疗。结果数据集，可访问通过用户友好在线应用，提供宝贵资源推进黑色素瘤生物学。

使用这些数据，我们意外观察增加细胞毒性NK细胞丰度在OT病灶从ICB难治患者和复现此发现在独立黑色素瘤和乳腺癌队列。与此一致，三近期研究描述关联 between NK细胞和缺乏应答免疫治疗在不同癌症类型。但基因表达分析指示NK群体描述这些研究不同于NK细胞我们识别在我们OT NR患者转移性黑色素瘤。

给定NK细胞群我们描述展示成熟和细胞毒性表型，我们观察 stark对比既往报告其中丰度细胞毒性NK细胞关联应答αPD-1疗法。空间分析揭示增加NK细胞丰度 confined to肿瘤周区域，近CD8⁺ T细胞和DCs，潜在解释 discrepancy。 thus，比较NK细胞丰度跨样本和研究将需考虑多样性在NK细胞表型及其空间分布。 Nevertheless，我们研究指示存在细胞毒性NK细胞在肿瘤边缘NR病灶在早期OT时间点可能是一预测生物标志物。

关键地，我们提供直接证据增加细胞毒性NK细胞在肿瘤周区域 upon ICB暴露是 causatively involved促进耐药 to ICB。改进ICB应答确实观察 after NK细胞耗竭在免疫排斥黑色素瘤和结肠癌模型。相反，NK细胞耗竭损害ICB应答在免疫浸润黑色素瘤（YUMM5.2和YUMM1.7），指示 context-dependent效应NK细胞 on ICB功效。

在免疫排斥黑色素瘤，耗竭NK细胞导致增加CD8⁺ T细胞，一表型恶化 upon αPD-1暴露。这些数据指示，在此肿瘤 context，ICB therapy诱导NK细胞招募和/或促进其成熟/细胞毒性在“错误”区室，导致减少CD8⁺ T细胞丰度和 dampened免疫细胞浸润。机制上，招募NK细胞至这些炎症区域依赖CX3CR1依赖性通路 as药理学靶向此通路逆转免疫排斥和增强敏感性 to αPD-1治疗在代表小鼠模型。然而，我们不能排除通过使用CX3CR1拮抗剂，其他免疫细胞类型 can被靶向。 Nevertheless，在此 scenario，CD8⁺ T细胞是关键 for ICB应答 as遗传消融CD8<su