淋巴结内调节性T细胞通过IL2限制抑制CD8+ T细胞杀伤功能促进肿瘤转移的机制研究

本研究发现淋巴结（LN）作为免疫器官却易受肿瘤转移定植，其内在机制并非既往认为的肿瘤源性因子预 conditioning，而是调节性T细胞（Treg）通过竞争性消耗IL2，抑制CD8+ T细胞杀伤功能，从而形成免疫豁免微环境。该研究揭示了LN转移的免疫学基础，为靶向IL2通路治疗淋巴结转移提供了新策略。

　　

引言

淋巴节点（LN）是抗肿瘤免疫的关键场所，但其对转移性定植的高度易感性构成一个悖论。先前研究认为肿瘤源性外源性因子预 conditioning 引流LN，通过促进免疫抑制状态实现肿瘤细胞存活。本研究探讨LN本身特性是否阻碍其清除转移肿瘤细胞的能力。

结果

肿瘤特异性CD8⁺ T细胞在LN中缺乏细胞毒性效应表型

通过流式细胞术分析非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血（PB）、肿瘤引流LN（tdLN）和原发肿瘤（PT）中的CD8⁺ T细胞，发现PB或PT来源的CD8⁺ T细胞高表达颗粒酶B（GZMB）和穿孔素，而tdLN来源的细胞缺乏这些分子。利用头颈鳞癌（HNSCC）患者的质谱流式数据进一步验证，记忆性CD8⁺ T细胞在tdLN中高表达干细胞样和记忆标志物（TCF1、CD27、CD127），而在PB中高表达GZMB，PT中高表达耗竭标志物（PD1、TIM-3、CD39）和组织驻留标志物（CD69、CD103）。黑色素瘤特异性（Melan-A/MART1-tetramer⁺）CD8⁺ T细胞的基因表达分析显示，PB来源细胞高表达效应分子基因（FGFBP3、GNLY、KLRG1、PRSS23），而肿瘤浸润LN（TILN）来源细胞高表达组织保留基因（CXCL13、ITGA1）和低表达组织出口基因（S1PR1、S1PR5）。小鼠模型中，OVA特异性OT-I T细胞在PB中持续高表达GZMA和GZMB，而在tdLN中仅短暂表达。这种细胞毒性分子表达缺失在不同肿瘤模型（乳腺癌EO771-OVA、结肠癌MC38-OVA、胰腺癌6694c2-OVA）和原位胰腺癌模型中均得到验证。内源性OVA特异性CD8⁺ T细胞（tetramer⁺）在tdLN中同样低表达GZMB和LAMP1，但体外刺激后IFNγ产生能力正常，表明LN中CD8⁺ T细胞保留细胞因子产生能力但缺乏细胞毒性。

LN对抗原性肿瘤细胞定植具有内在易感性

通过极限稀释实验直接比较LN注射和静脉注射后肿瘤形成效率，发现抗原性（OVA⁺）肿瘤细胞在LN中形成肿瘤的效率比静脉注射高6-35倍，而亲本细胞无此差异。MC38结肠癌细胞（表达显性新抗原）在LN注射中也显示优势，但在T细胞缺陷Rag knockout小鼠中消失。LN注射本身不损伤免疫应答能力，PBS注射后仍能有效清除肿瘤并扩增OVA-tetramer⁺ CD8⁺ T细胞。Nur77^GFP/OT-I小鼠模型显示，LN注射导致OT-I细胞扩增最强且无耗竭标志物增加。在已建立抗肿瘤记忆的小鼠（LLC-OVA肿瘤切除后40天）中，LN注射仍赋予肿瘤形成优势，静脉注射则无肿瘤形成，表明LN内在特性允许抗原性肿瘤生长。

T细胞对淋巴管和血行肺转移施加不同压力

在自发性转移模型中，抗原性胰腺癌细胞（6694c2-OVA）在持续T细胞 depletion 时转移频率近似亲本细胞，部分T细胞恢复后，血行肺转移频率降低3倍（70%至23%），而淋巴管转移至胰腺LN频率不变（约25%）。临床数据（MSK-MET数据集）分析显示，结直肠腺癌中微卫星不稳定（MSI）和高肿瘤突变负荷（TMB）与转移负相关，且对肝和肺（血行转移）的负相关最强，对区域或远处LN（淋巴转移）最弱，表明抗原性可能更显著限制血行转移。

Treg通过IL2限制抑制LN中肿瘤特异性CD8⁺ T细胞的细胞毒性分子产生

免疫缺陷小鼠（NOD-SCID、Rag1^KO）中OT-I T细胞在tdLN中GZMB production 增加，提示T细胞亚群负责抑制。Foxp3^DTR小鼠中Treg depletion 显著增加tdLN中OT-I T细胞的GZMB、GZMA和穿孔素 production，达到PB水平。机制上，TGFβ或IL10 blockade 无效果，而IL2 blockade 在Treg depletion 后阻止细胞毒性分子获得，表明Treg通过限制IL2抑制CD8⁺ T细胞。在已建立记忆的模型中，Treg depletion 诱导记忆OT-I细胞（T_EM和T_CM）细胞毒性分子表达，且为IL2依赖性。高剂量重组IL2（rIL2）处理表型复制Treg depletion，增加细胞毒性分子表达并减少干细胞样（T_SL）群体。

Treg通过隔离IL2使肿瘤细胞在LN中存活 by 抑制CD8⁺ T细胞杀伤能力

从Treg depletion 小鼠tdLN分离的OT-I T细胞杀伤肿瘤细胞效率提高近3倍，且依赖体内IL2暴露。人PDAC快速 autopsy 样本中，tdLN cubes 暴露于rIL2后，CD8⁺ T细胞诱导靶细胞凋亡和递送GZMB能力增强。Foxp3^DTR小鼠中，LLC-OVA肿瘤在LN中的清除依赖Treg depletion、CD8⁺ T细胞和IL2。rIL2治疗在Treg存在时也足以消除LN中肿瘤形成。极限稀释分析显示，Treg depletion 消除OVA⁺肿瘤细胞在LN中的生长优势。未发现肿瘤特异性Treg诱导或MHC-II表达依赖。

Treg-CD8⁺ proximity 在人类tdLN中高于原发肿瘤

单细胞RNA/TCR测序数据显示，匹配克隆（相同TCR）的CD8⁺ T细胞在转移LN中IL2 signaling 签名低于PT，而Treg在转移LN中IL2 signaling 签名升高，最高上调基因为ICOS（增加Treg对IL2敏感性和依赖性）。空间分析显示，在未受累LN（uiLN）和转移LN中，Treg与PD1⁺ CD8⁺ T细胞最近距离仅16μm，每个PD1⁺ CD8⁺ T细胞25μm内有近5个Treg，而在PT中最近距离远3-4倍，表明Treg在LN中更靠近CD8⁺ T细胞，可能更有效隔离IL2。

局部Treg depletion 预防LN转移

个体患者tdLN中Treg频率和IL2RA表达与CD8⁺ T细胞GZMB production 负相关。低剂量DT局部注射 inguinal LN 特异性 depletion Treg，显著减少皮下6694c2L肿瘤转移至 inguinal LN，而不影响PT大小。

讨论

本研究识别LN内在机制，即Treg通过IL2限制局部抑制CD8⁺ T细胞杀伤功能，促进肿瘤转移。CD8⁺ T细胞表型区室化：PB中细胞毒性强，PT中效应兼耗竭，tdLN中干细胞样/记忆但缺乏细胞毒性。Treg suppression 依赖IL2竞争而非TGFβ/IL10或肿瘤特异性Treg诱导。LN中Treg-CD8⁺ 近距离 proximity 可能增强IL2隔离效率。该机制可能进化上利于维持外周耐受和保存干细胞样群体，但代价是易受肿瘤定植。靶向IL2通路（如新一代IL2 immunotherapy）或局部Treg depletion 可能治疗LN转移。