基于DNA甲基化与机器学习算法的宫颈癌早期筛查新方法：CervicalMethDx测试在HPV阳性人群中的验证研究

本刊推荐：本研究验证了CervicalMethDx检测作为HPV阳性女性分诊工具的卓越性能。该检测通过qMSP技术分析ZNF516、FKBP6和INTS1基因启动子甲基化水平，结合机器学习算法，对CIN2/CIN3病变的检测灵敏度达92%，特异性达99%（AUC=0.96）。其高精度分诊能力可显著减少不必要的阴道镜转诊，为宫颈癌筛查提供创新性解决方案。

　　

Abstract

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。尽管通过细胞学筛查和人乳头瘤病毒（HPV）检测在预防和早期检测方面取得进展，但如何对HPV阳性女性进行适当的分诊以指导阴道镜和活检仍存在挑战。本研究旨在验证CervicalMethDx测试（一种用于宫颈癌检测的精准DNA甲基化分类器）作为HPV阳性样本的反射性检测手段。

Introduction

过去几十年中，由于筛查项目的广泛开展，宫颈癌发病率已降低一半以上。通过细胞学和高危HPV（hrHPV）检测的定期监测，以及基于HPV疫苗接种的预防策略，显著降低了该疾病的发病率和总体死亡率。然而，这种趋势因种族、民族、地理区域和社会经济地位而异。拉丁裔和非裔美国女性相比非拉丁裔白人女性有更高的宫颈癌发病率和死亡率。

当前宫颈癌筛查算法已随着HPV检测的采用而发生显著转变。持续感染HPV基因型（特别是16和18型）对宫颈癌的发展和进展至关重要。目前指南建议，HPV检测作为风险评估工具优于传统细胞学，具有更高的敏感性和整体性能。然而，HPV检测无法准确区分具有临床相关早期病变（癌症发展风险增加）的女性与可能自发消退的短暂病变女性。这一缺陷导致过度转诊和过度治疗率增加，凸显了对更精确风险分层的迫切需求。

Materials and Methods

Cohort characteristics and inclusion/exclusion criteria

一项非连续便利队列研究包含1,120个去标识化样本，来自美国大型转诊临床实验室的PreservCyt介质中的特征明确样本。所有选定样本基线时均来自接受Pap涂片分诊的女性，未接受过治疗，且无既往不典型增生或癌症诊断。最终共有527个样本用于进一步分析：经穿刺活检组织学诊断为CIN2（n=210）或CIN3（n=141），以及n=176例NILM对照。

Patient samples

妇科医生在临床实践中使用刷型或细胞刷/刮匙采集装置收集接受细胞学检测女性的宫颈标本，随后在ThinPrep Pap Test小瓶中冲洗。小瓶通过美国交通部认证的临床样本运输快递发送。样本在实验室进行Pap和HPV测试后，在PreservCyt样本运输介质中的废弃临床样本在去标识化后获得。

PreservCyt vials processing

PreservCyt小瓶置于Tomcat仪器上进行自动化处理。该仪器是全自动液体处理器，旨在通过消除手动等分样本所需低效且易出错的活动来减轻分析前样本处理的压力。

HPV genotyping

ThinPrep检测用于Pap测试。Aptima HPV检测和Aptima HPV基因分型检测用于确定HPV状态和基因型。Aptima HPV检测是一种靶标扩增核酸探针测试，用于体外定性检测14种高危型HPV的E6/E7病毒mRNA。

Biopsy specimen processing

妇科医生在临床实践中收集活检标本，置于固定液中，并通过快递送至临床实验室。活检标本放入盒中，通过自动化机器处理，将组织固定并放入蜡中。随后在切片机上切割组织，将切片置于玻璃显微镜载玻片上，用苏木精和伊红染色，加盖玻片，放入带有随附申请单的托盘，并交给病理学家进行显微镜检查。

Promoter DNA methylation profiling

使用EpiTect Fast LyseAll Bisulfite试剂盒，按照制造商方案定量CervicalMethDx测试中三个基因的启动子DNA甲基化：ZNF516、FKBP6和INTS1。

Methylation-specific PCR

通过甲基化特异性PCR（qMSP）评估硫酸盐修饰基因组DNA的甲基化分析，使用QuantStudio 6 Flex进行优化。在单次PCR运行中，分析了先前设计的引物和探针，以特异性扩增ZNF516、FKBP6和INTS1的启动子区域。

Sample size calculation and power analysis

样本量基于样本可用性和该领域先前研究确定。选择该方法是为了在平衡物流限制的同时，获得可靠且有意义的结果。

Statistical analysis

使用QuantStudio Real-Time PCR软件分析、解释实时PCR数据并导出为.csv文件。进行无监督层次聚类，在中心化数据并计算所有样本间距离后将观测值加入聚类。执行主成分分析（PCA）以确定每个主成分（PC）解释的方差，从而说明它们对整体数据变异性的相对贡献。

Results

DNA甲基化分析用于区分细胞学异常且组织病理学诊断为CIN2/CIN3+的HPV阳性样本（n=351）与NILM样本（n=176）。无监督层次聚类用于根据CervicalMethDx测试中三个基因的DNA甲基化谱相似性对样本进行分组，无需事先了解组织病理学诊断。该分析显示，ZNF516和FKBP6紧密聚集，表明这两个基因是具有CIN2和CIN3组织病理学诊断样本的特异性生物标志物。

PCA散点图表明，通过PC1和PC2可以很好地区分一部分CIN2或CIN3样本（PreM）与NILM样本（N）。三个PC捕获方差的箱线图进一步强化了PC1和PC2可以区分大多数癌前样本的概念，而PC3的贡献范围相当有限。

Diagnostic performance of individual methylation genes

CervicalMethDx测试的诊断性能针对每个标记物在不同组织学亚型NILM、CIN2和CIN3中的甲基化水平进行了分析。逻辑回归模型在六个训练的模型中具有最高准确度。AUC分析和逻辑回归后估计统计数据显示，CervicalMethDx测试正确分类了95%的CIN2样本（n=210），灵敏度为91%，特异性为100%，AUC为0.96；正确分类了94%的CIN3样本（n=141），灵敏度为90%，特异性为100%，AUC为0.96。此外，CervicalMethDx测试正确分类了94%的合并CIN2/CIN3样本（n=351），灵敏度为92%，特异性为97%，AUC为0.96。

Discussion

CIN1（LSIL）主要由短暂性HPV感染引起，具有很高的自发消退率（约90%），很少进展为浸润性癌。另一方面，CIN2和CIN3（HSIL）具有显著更高的进展风险，特别是CIN3，如果不治疗，有30%至50%的机会发展成浸润性鳞状细胞癌。临床上，CIN1通常采用保守管理，进行观察和随访（重复细胞学和HPV检测），因为它通常会消退。CIN2病变也越来越多地被一些医生采用保守管理，进行观察和随访。CIN3已被视为浸润性宫颈癌的直接前兆，需要明确治疗。

据我们所知，这是第一个基于qMSP数据的DNA甲基化算法，利用强大的生物统计学、生物信息学和机器学习工具，在对HPV阳性女性进行阴道镜驱动活检转诊之前，对最有可能被解剖病理学家诊断为CIN2和CIN3的女性进行分诊。

无监督层次聚类是表观基因组范围DNA甲基化数据分析中广泛使用的强大统计方法，用于提高生物标志物识别的准确性，提高特异性和敏感性，并有助于疾病亚型分型。我们的精准DNA甲基化算法进行了无监督层次聚类，在中心化数据并计算所有样本间距离后，将CervicalMethDx测试中三个基因的单重qMSP观测值加入聚类。该分析显示，ZNF516和FKBP6是具有CIN2和CIN3组织病理学诊断样本的生物标志物。

PCA可以揭示仅从原始数据中可能不明显的潜在结构，通过可视化最显著的变异模式以及观测值之间的关系。PCA散点图用于分析投影到PC上时数据点的分布和关系。这些图提高了我们对不同变量如何相互关联的理解。图2中的PCA散点图显示，CervicalMethDx测试清楚地区分了一部分PreM与NILM样本（N）。

PCA箱线图是跨样本多个基因甲基化水平分布的视觉表示。解释本研究中CervicalMethDx测试PCA箱线图涉及理解DNA甲基化模式在具有Pap涂片病变的HPV阳性样本中如何变化，以及它们如何可能与CIN状态相关。图3中的箱线图显示NILM（N）和PreM内基因间一致的甲基化模式，从而提供了CervicalMethDx测试在将具有Pap涂片病变的HPV阳性样本分诊至阴道镜方面有用性的进一步证据。

DNA甲基化基于机器学习工具和算法已展现出强大的诊断能力。我们的数据显示，DNA甲基化基于机器学习算法也能够区分癌前宫颈癌组织与正常组织。无创DNA甲基化检测因其在几乎任何体液中的可行性和可重复性而成为一种有前途的诊断工具。在本研究中，我们证明CervicalMethDx测试与宫颈癌进展相关，因为我们发现与NILM样本相比，CIN2/CIN3样本中的DNA甲基化水平显著更高。我们的结果表明，CervicalMethDx测试具有高区分能力来识别CIN2/CIN3风险，并且可以补充当前阴道镜转诊的分诊方法。

CervicalMethDx测试可以通过提供高度可靠的评估来克服美国现有宫颈癌筛查中的差距，无需召回患者，并且在与hrHPV结合使用时有可能降低阴道镜转诊率。事实上，Zhang及其同事证明，一组甲基化基因（ZNF671、ASTN1、ITGA4、RXFP3、SOX17和DLX1）与HPV16/HPV18基因分型结合，在大规模前瞻性基于人群队列的自收集样本中检测CIN2⁺时，阴道镜转诊减少了44.4%，灵敏度和特异性分别为83%和69.9%。

除了DNA甲基化检测，用于分诊hrHPV⁺女性的替代分子标志物包括p16/Ki67双重染色，已证明对CIN2⁺/CIN3⁺具有更高的敏感性，并且特异性不劣于Pap测试。然而，尽管其广泛使用，p16/Ki67双重染色在不会进展为癌症的短暂性HPV感染病例中增加了假阳性结果，导致不必要的随访程序。此外，其依赖显微镜评估引入了读者间变异性，使得结果可重复性较差，需要高度熟练的专业人员和专门的基础设施。相对较低的特异性（约59%）通常需要在阴道镜转诊前进行额外的诊断测试，延迟临床决策。类似地，细胞学检查（Pap测试）在其高转诊率方面面临自身挑战，因为其高度可变的敏感性（范围32%至87%），通常需要重复测试或额外的分子标志物以提高准确性。

在此背景下，CervicalMethDx测试可能适用于资源较低地区，因为其可行性、较低的实施成本以及与自收集的兼容性，使用与hrHPV测试相同的样本，且DNA输入要求低。与依赖显微镜解释的方法不同，CervicalMethDx消除对高度培训人员和复杂实验室基础设施的需求，使其更容易在医疗资源有限的环境中部署。此外，CervicalMethDx实施完全自动化，并且在护理点需要最少的计算资源，通过使用预定义的甲基化标志物和标准化解释算法，无需本地计算机专业知识即可获得更快速和改进的结果。然而，在CervicalMethDx在临床实验室可用之前，需要规划监管、报销和生产路径。

总之，我们成功地对一个特征明确的废弃细胞学宫颈样本队列进行了一项盲法回顾性研究，使用CIN2和CIN3组织学终点验证CervicalMethDx作为基于风险的分诊测试方法整合到宫颈癌筛查算法中。我们的结果支持该测试的进一步验证和潜在整合，以准确分诊处于宫颈不典型增生风险增加中的女性。这种无创测试快速、可行、低成本，适用于多种环境，包括资源较低地区。该测试可以进一步开发为独立诊断工具，或优选与hrHPV测试结合使用。当前测试需要在具有良好特征的人口统计学、临床和病理结果数据的前瞻性收集独立队列中进一步验证。