Seclidemstat（SP-2577）通过逆转FET融合蛋白转录活性在多种肉瘤中展现广谱抗肿瘤潜力

本研究深入探讨了非竞争性LSD1抑制剂seclidemstat（SP-2577）在FET重排肉瘤中的药理机制。通过体外实验和转录组学分析，发现该化合物能有效抑制多种肉瘤细胞系（包括尤文肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、透明细胞肉瘤和黏液样脂肪肉瘤）的活力，并逆转EWSR1::FLI1、EWSR1::ERG、EWSR1::WT1和EWSR1::ATF1等融合癌蛋白的转录程序。研究证实seclidemstat与先导化合物SP-2509具有相似的转录调控特性，通过干扰LSD1复合物功能而非其催化活性发挥作用，为FET重排肉瘤提供了新的靶向治疗策略。

　　

非竞争性LSD1抑制剂在FET重排肉瘤细胞系中显示出显著活性

研究团队通过细胞活力测定评估了seclidemstat（SP-2577）对多种FET重排肿瘤细胞系的作用。实验涵盖了尤文肉瘤细胞系（A673、TC32、SK-N-MC和TTC-466）、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤（DSRCT）细胞系（JN-DSRCT-1和BER）、透明细胞肉瘤细胞系（SU-CCS-1和DTC1）以及黏液样脂肪肉瘤细胞系（1765-92、402-91和DL221）。这些细胞系分别表达不同的FET融合蛋白，包括EWSR1::FLI1、EWSR1::ERG、EWSR1::WT1、EWSR1::ATF1和FUS::DDIT3。

研究结果显示，所有测试的尤文肉瘤细胞系对SP-2509敏感，IC₅₀值范围在30至500 nmol/L之间，而对OG-L002（一种不可逆LSD1抑制剂）则没有可确定的IC₅₀值（高达30 μmol/L）。尤文肉瘤细胞也对seclidemstat敏感，IC₅₀值范围在290至700 nmol/L之间。这种体外效力的轻微降低是预期的，因为SP-2509结构中的吗啉环促进了细胞渗透性，而seclidemstat则含有N-甲基哌嗪，这改善了制剂、溶解度、口服生物利用度和药代动力学，但可能降低组织培养测定中的渗透性。值得注意的是，SP-2513（一种结构类似但无LSD1活性的化合物）在细胞活力测定中没有显示活性，IC₅₀值在30 μmol/L以下无法确定。

在DSRCT和透明细胞肉瘤中观察到类似的活动模式。在两个测试的DSRCT细胞系中，SP-2509和seclidemstat的IC₅₀值分别为300 nmol/L至1.1 μmol/L和500 nmol/L至1.5 μmol/L。透明细胞肉瘤细胞系的IC₅₀值范围对于SP-2509为80 nmol/L至1.4 μmol/L，对于seclidemstat为250 nmol/L至1.6 μmol/L。在这些细胞系中，OG-L002和SP-2513的IC₅₀值在30 μmol/L以下无法确定。同样，OG-L002和SP-2513在任何黏液样脂肪肉瘤细胞系中均未显示活性。

在黏液样脂肪肉瘤细胞系中，SP-2509和seclidemstat的效力变化较大。1765-92和402-91的IC₅₀值对于SP-2509在500至850 nmol/L之间，对于seclidemstat在450 nmol/L至1.1 μmol/L之间。相比之下，DL221细胞系更为耐药。由于在30 μmol/L以下没有足够的数据来确定曲线的底部，无法拟合四参数剂量-反应曲线，超过此浓度会遇到与溶解度相关的挑战。因此，将曲线的底部固定为0，并使用估计的IC₅₀值。跨重复的IC₅₀值对于SP-2509在4.2至7.5 μmol/L之间，对于seclidemstat在3.8至4.7 μmol/L之间。

综上所述，这些数据表明seclidemstat在所有测试的细胞系中具有与SP-2509相当的效力。此外，其他FET重排肿瘤显示出类似的活动模式，对非竞争性LSD1抑制剂敏感，但对不可逆或催化抑制剂OG-L002不敏感。这表明细胞毒活性不需要抑制LSD1酶活性。例外是DL221黏液样脂肪肉瘤细胞系，其对非竞争性抑制剂有些耐药。尽管如此，SP-2509和seclidemstat在该细胞系中显示出比OG-L002和SP-2513更多的活性。

研究还发现，这种化合物活动模式并非FET重排肉瘤特有。在融合阳性横纹肌肉瘤（FP-RMS）细胞系RH4（PAX3::FOXO1）、RH30（PAX3::FOXO1）和CW9019（PAX7::FOXO1）中分析了SP-2509、SP-2513和OG-L002的额外数据。已有报道称seclidemstat在RMS体内模型中具有某些活性，研究发现FP-RMS细胞系也对SP-2509治疗敏感，所有测试细胞系的IC₅₀值均低于1 μmol/L。与FET重排细胞系类似，SP-2513和OG-L002显示很少的细胞毒活性。

额外的生物信息学工具确认转录组分析中的细胞系和数据完整性

研究使用计算的剂量反应曲线估计每个细胞系中90%细胞被杀死的剂量（IC₉₀），并将此剂量用于转录组分析，以匹配先前在尤文肉瘤细胞中使用SP-2509所做的研究。细胞用DMSO载体或seclidemstat处理48小时后收集。收集细胞，并将RNA提交进行RNA测序（RNA-seq）分析。

尽管实验室定期对所有使用的细胞系进行短串联重复（STR）分析，但本研究中的一些细胞系（DTC1和DL221）没有公开的参考谱。因此，作为另一层质量控制，使用EnFusion流程从RNA-seq数据中检测每个细胞系中表达的融合转录本。该流程证实了A673和TTC-466细胞系中分别表达EWSR1::FLI1和EWSR1::ERG。在两个DSRCT细胞系JN-DSRCT-1和BER中检测到EWSR1::WT1，每个细胞系预测有不同的断点。SU-CCS-1和DTC1均被证实表达EWSR1::ATF1，且预测有相同的断点。值得注意的是，尽管DL221与其他两个黏液样脂肪肉瘤细胞系之间存在巨大差异，但所有三个细胞系均检测到FUS::DDIT3的表达。

由于SP-2509和seclidemstat均抑制LSD1，且LSD1可根据细胞类型被纳入具有不同功能的不同复合物中，接下来检查了任何已知的LSD1相互作用因子在DL221细胞中是否显示与其他细胞系相比显著改变的表达。尽管DL221与其他黏液样脂肪肉瘤细胞系分开聚类，但它与其他敏感细胞系聚类在一起，并且未发现与敏感性相关的LSD1相互作用因子的表达水平。

作为质量控制的最后一步，并确保样品和数据的正确处理，使用统一流形逼近与投影（UMAP）评估所有用于分析的RNA-seq样品。发现样品（无论处理还是未处理）首先按疾病聚类，其次按细胞系聚类。这些数据表明，疾病间的变异性推动了样品间转录组的最大差异，这是预期的。

Seclidemstat治疗在尤文肉瘤中以与SP-2509类似的方式改变转录

在确认适当的融合表达和样品聚类后，分析了用seclidemstat处理的细胞的差异表达数据。首先询问seclidemstat治疗是否与SP-2509治疗相似，以及seclidemstat治疗如何影响LSD1调节和EWSR1::FLI1调节的基因。为此，重新分析了来自Pishas及其同事的最新SP-2509数据，并使用当前的RNA-seq流程与seclidemstat进行比较。发现SP-2509和seclidemstat均上调和下调数千个基因的表达，在两种治疗条件下的差异表达基因（DEG）有显著重叠。

同样，使用基因集富集分析（GSEA），发现在seclidemstat和SP-2509下调的基因中有显著的功能相似性（归一化富集分数NES，-3.0488），在上调的基因中也是如此（NES，2.7995）。这些数据证明在A673尤文肉瘤细胞中，seclidemstat引起的转录变化与SP-2509有显著相似性。

在显示seclidemstat在很大程度上重现了SP-2509的转录效应后，还确定了seclidemstat在多大程度上破坏了EWSR1::FLI1转录活性和LSD1在尤文肉瘤细胞中的功能。如上所述，使用当前流程重新处理了先前发布的EWSR1::FLI1调节和LSD1调节基因的数据。重要的是，对EWSR1::FLI1基因调节的分析仅使用在敲低（KD）-拯救实验中通过EWSR1::FLI1拯救检测到的DEG。这将分析限制在受EWSR1::FLI1表达调节的基因，并排除了那些表达变化作为RNAi介导的KD的脱靶效应的基因。

SP-2509、seclidemstat、EWSR1::FLI1和LSD1 DEG的四向Venn重叠显示，在seclidemstat下调的基因与LSD1和EWSR1::FLI1上调的基因之间有显著重叠，反之亦然。有趣的是，在seclidemstat和LSD1下调的基因与EWSR1::FLI1下调的基因之间也有一些重叠，以及seclidemstat和LSD1下调的基因与EWSR1::FLI1上调的基因之间，这种模式在SP-2509中未见。seclidemstat治疗与LSD1功能逆转之间的关联比EWSR1::FLI1更强。

使用GSEA，发现LSD1上调的基因被seclidemstat下调（NES，-2.4373），LSD1下调的基因被seclidemstat上调（NES，2.16）。对于EWSR1::FLI1，激活和抑制的基因均与seclidemstat上调更强烈相关（NES，1.8047和NES，1.3087 respectively）。有几个因素可能导致这些发现。首先是与SP-2509相比，seclidemstat预期的细胞渗透性降低，其次是与SP-2509（2 μmol/L）相比，seclidemstat使用的剂量相对较低（约1 μmol/L）。两者都可能降低相同组织培养条件下seclidemstat的有效剂量，这得到了seclidemstat调节的基因总数低于SP-2509的支持。

综上所述，seclidemstat治疗显著影响EWSR1::FLI1调节和LSD1调节的基因，并且与SP-2509治疗非常相似。

Seclidemstat治疗广泛改变FET重排肉瘤中的基因调节

鉴于在细胞活力测定中观察到的活性，接下来询问seclidemstat是否也改变具有其他FET融合蛋白的细胞系中的基因调节。如在A673细胞中所见，seclidemstat治疗改变了所有测试细胞系中数千个基因的表达。这对于上调基因和下調基因都是如此。

此外，在每个疾病类别内的细胞系中，seclidemstat调节的基因存在显著的功能重叠（即共同上调的DEG和共同下调的DEG）。尽管在一个给定疾病中seclidemstat调节的基因存在显著相似性，但也想了解在所有测试细胞系中共同受seclidemstat调节的基因和通路。首先使用Upset图查看共同调节的基因。这些分析显示，对于seclidemstat上调和下调的基因，主要的DEG是每个细胞系特有的。也有每个疾病类型特有的DEG，但这些通常比每个细胞系特有的DEG少得多。共同调节的DEG如此之少，以至于在Upset图的前40个类别中未包含该类别，无论是对于上調还是下調的DEG。

接下来使用通路分析评估跨细胞系受seclidemstat治疗调节的相关通路。对于此分析，测试了来自MSigDB策划基因集、基因本体论生物过程和基因本体论分子功能的通路特征。与细胞周期、RNA加工、线粒体和代谢、胚胎干细胞程序、DNA复制以及转录因子和辅因子结合相关的基因特征在seclidemstat治疗后下调。相反，与细胞信号传导、发育、EWSR1::FLI1和PAX3::FOXO1抑制靶标以及细胞对饥饿反应相关的基因特征均在seclidemstat处理的细胞中上调。

综合考虑，这些分析表明，尽管每个细胞系中有一些独特的DEG集，但seclidemstat治疗下调了涉及致癌作用的细胞通路，如增加的增殖和更去分化的状态，并上调了涉及细胞信号传导、分化和发育的通路，这些通路被融合癌基因抑制。这些发现表明，在FET重排肿瘤中可能存在共同的转录调节机制，这些机制被非竞争性LSD1抑制剂治疗所破坏。

为了进一步探索这类化合物的转录活性是否特定于表达FET重排癌基因的细胞，包括了来自FP-RMS细胞在用2 μmol/L SP-2509处理48小时后的额外转录数据（RNA-seq）。FP-RMS样品在所有细胞系的UMAP分析中聚类在一起。如在其他细胞系中所见，治疗导致大量上调和下调的DEG。发现FP-RMS细胞系之间DEG的疾病内重叠变异性大于其他FET融合。有趣的是，对所有细胞系的Upset图重叠分析显示，在FP-RMS中发现的DEG与FET重排肉瘤中发现的DEG之间重叠相对较少。

此外，当将FP-RMS样品纳入通路分析时，发现跨细胞系改变的通路变异性大于仅关注含有FET重排的细胞系时。值得注意的是，在肺泡RMS中上调的基因在所有FP-RMS细胞系中被SP-2509治疗下调，但在任何FET重排系中均未出现。与缺氧相关的基因下调，与复制相关的基因也是如此，以及编码与DNA和细胞骨架元件结合的蛋白质的基因。与自噬相关的基因下调，与发育相关的基因根据细胞系和特定发育通路上调或下调。

总之，这些数据表明，N'-(2-羟基亚苄基)酰肼治疗调节了本研究中测试的肉瘤细胞类型的一些共同通路，并且FET重排肉瘤的反应包含一组不同的共同通路。

FET融合蛋白在基因调节中显示出显著相似性

为了评估seclidemstat治疗对FET融合癌基因转录功能的影响，首先重新分析了四个具有不同FET融合的细胞系的公开可用RNA-seq数据集：A673（如上所述）、JN-DSRCT-1、BER和DTC1。这些数据集被下载并使用内部RNA-seq流程处理，以定义由融合表达调节的基因。还为TTC-466细胞中的EWSR1::ERG生成了一个新的RNA-seq数据集，使用与上述A673类似的方法。

简而言之，使用针对3'非翻译区的shRNA进行标准KD-拯救实验，以耗尽内源性EWSR1::ERG，并用编码EWSR1::ERG的shRNA抗性cDNA拯救，类似于先前在EWSR1::FLI1实验中报道的方法。TTC-466细胞耐受EWSR1::ERG KD/拯救，拯救构建体的表达水平与EWSR1::FLI1和EWSR1::ERG所见相似，软琼脂中的生长拯救与EWSR1::FLI1所见相当，并且拯救了致癌转录特征。在显示此KD/拯救有效后，将EWSR1::ERG特征定义为表达EWSR1::ERG拯救构建体的细胞与KD条件相比差异表达的基因。

所有五种融合转录特征的重叠分析揭示了大量重叠，有847个共同上调的基因和351个共同下调的基因，并且每个融合的上调和下调基因之间的各自 pairwise 比较中存在显著重叠。这些数据证实了Gedminas及其同事先前的报告，即在JN-DSRCT-1和BER中EWSR1::WT1的DEG特征存在显著重叠，以及两个DSRCT细胞系与EWSR1::FLI1特征之间也存在显著重叠。值得注意的是，EWSR1::ATF1 DEG特征也显示与所有其他测试的融合显著重叠。

尽管存在这些显著重叠，但最主要的DEG集是每个细胞系特有的。下一个最主要的DEG集是每个疾病共有的，然后是所有融合共有的，对于上调和下调的基因都是如此。共同上调的基因比共同下调的基因多，这可能反映了存在这些融合时转录激活的共同机制。

Seclidemstat治疗逆转FET融合转录活性

在最后一项分析中，询问seclidemstat治疗是否阻断了其他疾病中FET融合蛋白的转录活性。在JN-DSRCT-1和BER细胞中，发现seclidemstat下调了大量EWSR1::WT1激活的基因，并上调了大量EWSR1::WT1抑制的基因。与上述EWSR1::FLI1的结果不同，seclidemstat下调与EWSR1::WT1抑制的基因没有显著重叠，seclidemstat上调EWSR1::WT1激活的基因也是如此。热图分析同样显示seclidemstat治疗后EWSR1::WT1转录特征的逆转。

重要的是，进一步关注EWSR1::WT1直接靶点的分析表明，seclidemstat治疗下调EWSR1::WT1激活的基因，并上调EWSR1::WT1抑制的基因。在DTC1细胞中EWSR1::ATF调节的基因和TTC-466细胞中EWSR1::ERG调节的基因的结果大致相同。在这些细胞系中，seclidemstat上调被融合抑制的基因，反之亦然，在seclidemstat上调与融合激活的基因之间或seclidemstat下调与融合抑制的基因之间没有显著重叠，并且在融合的直接靶点观察到融合活性的逆转。

这些数据表明，seclidemstat逆转了多种FET融合蛋白的转录活性，特别是EWSR1::FLI1、EWSR1::ERG、EWSR1::WT1和EWSR1::ATF1。这一发现与seclidemstat治疗后改变的共同通路集基本一致，并且不同疾病中不同融合调节的基因的相似程度一致。

讨论

综上所述，发现seclidemstat对来自患者肿瘤的具有多种不同FET和非FET融合癌基因的细胞显示出 potent 活性。与先前在尤文肉瘤和DSRCT中的报道类似，细胞活力受到两种非竞争性抑制剂SP-2509和seclidemstat的影响，但不受OG-L002的影响，表明对于所有测试的肿瘤类型，抑制LSD1的催化功能不是足够的抗肿瘤策略。

对此的一种可能解释由Sehrawat及其同事证明，其中SP-2509治疗而非催化性LSD1抑制剂破坏了LSD1与关键辅调节因子ZNF217之间的相互作用。LSD1是多个染色质辅调节复合物的一部分，并已被证明具有非催化活性，包括置换组蛋白乙酰转移酶和作为支架与其它蛋白质如HDAC、转录因子和泛素特异性蛋白酶相互作用。LSD1复合物的具体组成及其在尤文肉瘤中的作用尚未明确定义，这是一个持续研究的领域。

另一个可能