激酶组重编程与MYCN抑制：Lorlatinib在ALK驱动神经母细胞瘤中的卓越疗效机制

本文推荐一篇深入研究第三代ALK抑制剂Lorlatinib（劳拉替尼）在治疗ALK驱动神经母细胞瘤中显著优于Crizotinib（克唑替尼）的分子机制的文章。研究通过化学蛋白质组学（MIB/MS）和转录组学（RNA-seq）技术，揭示了Lorlatinib通过强力抑制ALK激酶活性、直接靶向G2/M期激酶（如PLK1、AURKA等），并下调致癌转录因子MYCN的表达，从而协同诱导细胞周期阻滞和凋亡的独特作用模式。这项工作不仅阐明了Lorlatinib克服临床耐药的全新机制，也为神经母细胞瘤的精准治疗提供了关键的理论依据。

　　

引言

神经母细胞瘤是一种起源于发育中交感神经系统的儿童恶性肿瘤，其临床表型具有高度异质性。在高危神经母细胞瘤患者中，存活率显著低于其他常见儿童癌症，且幸存者常面临终身健康问题。间变性淋巴瘤激酶（ALK）癌基因的功能获得性突变是遗传性神经母细胞瘤的主要病因，而体细胞ALK改变则是散发性疾病中最常见的单核苷酸突变。这些激活突变主要集中在三个热点残基（F1174、F1245和R1275），其中F1174和F1245变异导致对第一代和第二代ALK抑制剂（如Crizotinib和Ceritinib）的原发性耐药。第三代ALK/ROS1抑制剂Lorlatinib能够克服这种原发性耐药，并在对Crizotinib无反应的患者来源异种移植（PDX）模型中诱导完全和持续的肿瘤消退。本研究旨在通过化学蛋白质组学方法，定量测量Lorlatinib和Crizotinib在临床相关ALK驱动神经母细胞瘤PDX模型中的功能性激酶组动力学，从而揭示Lorlatinib卓越疗效的潜在机制。

材料与方法

研究使用了多种人类神经母细胞瘤来源的细胞系和PDX模型，包括SH-SY5Y（ALK^F1174L）、NB-1643（ALK^R1275Q）、FELIX（ALK^F1245C）、COG-N-453x（ALK^F1174L）和NB-1（ALK扩增）。这些模型通过短串联重复分析和支原体检测进行常规基因分型和质量控制。小鼠模型采用雌性CB17 SCID小鼠，皮下移植肿瘤后进行药物处理。Crizotinib和Lorlatinib由Pfizer Inc.提供，分别以100 mg/kg每日一次和10 mg/kg每日两次（5 mg/kg bid）的剂量通过口服灌胃给药。

化学蛋白质组学分析采用多重抑制剂珠与质谱联用（MIB/MS）技术，定量测量激酶组中50%–60%的激酶活性。蛋白质提取物通过MIBs富集，经胰蛋白酶消化后，在Easy nLC-1000装置上分离，并在QExactive质谱仪上进行分析。Western blot分析用于验证关键蛋白的表达和磷酸化状态。qRT-PCR和RNA-seq用于转录组水平的变化分析。此外，还进行了CRISPR-Cas9和CRISPRi基因编辑、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和ChIP qPCR等实验，以深入研究MYCN在G2/M激酶启动子上的结合和调控作用。

化学蛋白质组学揭示差异ALK抑制抗肿瘤活性的机制

为了评估ALK抑制后的激酶组重编程，研究选择了五种涵盖神经母细胞瘤患者中常见ALK异常（热点突变和扩增）的PDX或细胞系衍生异种移植（CDX）模型。荷瘤小鼠接受Crizotinib或Lorlatinib治疗6天后，收集肿瘤组织进行蛋白质提取和MIB/MS分析。结果显示，共定量了239种人类激酶，几乎覆盖了人类激酶组的一半。聚合分析表明，激酶组在响应ALK抑制剂时发生动态重编程，Lorlatinib相较于Crizotinib更显著地抑制了ALK及一系列其他激酶的MIB结合。

Lorlatinib在所有模型中均能强效且持续地抑制ALK，而Crizotinib仅诱导部分ALK抑制。此外，Lorlatinib还显著抑制了其他已知直接靶点，如FAK1、FAK2、ACK1和FER。通过体外竞争实验，证实Lorlatinib直接与这些激酶的ATP结合口袋结合，从而竞争性抑制其MIB结合。此外，Lorlatinib还抑制了此前未报道的靶点，如GRK6、MAP2K3、MAP2K4、MAP2K6，以及参与G2/M细胞周期转换的激酶PLK4、STK10和SLK。

Lorlatinib优先抑制FAK1/PTK2和FAK2/PTK2B激酶活性

所有四种ALK驱动模型均显示出相似但 distinct 的激酶组重编程模式。Lorlatinib处理显著抑制了FAK1、FAK2、FER和ACK的MIB结合。FAK1和FAK2是非受体蛋白酪氨酸激酶，作为调节细胞增殖和存活的关键信号蛋白。FER是一种非跨膜酪氨酸激酶，调节细胞间粘附。尽管Lorlatinib强效抑制这些激酶，但药理学抑制或CRISPR介导的PTK2或FER耗竭并未使细胞对Crizotinib敏感，表明这些激酶并非Lorlatinib抗肿瘤活性的关键介质。

Lorlatinib强效下调参与G2/M细胞周期转换的多种激酶

基因本体分析显示，Lorlatinib处理后在所有四种ALK驱动神经母细胞瘤模型中，G2/M细胞周期转换和 mitotic nuclear division 是最富集的通路。 across the models, 多种参与G2/M细胞周期转换的激酶，如MELK、PKMYT1、PLK1、PLK4和WEE1，被Lorlatinib更显著地抑制其MIB结合。其中，COG-N-453x PDX（ALK^F1174L）表现出最 distinct 的G2/M激酶组重编程模式，AURKA、AURKB、AURKC、BUB1、CDK1、CHEK1、MELK、NEK2、PKMYT1、PLK1和PLK4等激酶被Lorlatinib显著下调。

qRT-PCR分析进一步验证了MIB/MS结果，显示Lorlatinib在NB-1643异种移植和COG-N-453x PDX中均能显著且持续地抑制G2/M激酶的转录水平。 Western blot分析证实，Lorlatinib处理导致PLK1蛋白水平的显著降低，而Crizotinib的效果较弱。 CRISPRi介导的ALK敲低也导致PLK1蛋白水平下降，表明ALK通过其激酶活性调节PLK1表达。

PLK1抑制使细胞对Crizotinib敏感并模拟Lorlatinib单药治疗

PLK1是G2/M期的关键调节激酶，在神经母细胞瘤等癌症的维持中起重要作用。 MIB/MS和qRT-PCR显示，Lorlatinib显著下调PLK1。免疫印迹分析证实，Lorlatinib处理导致NB-1643异种移植和COG-N-453x PDX中总PLK1蛋白的耗竭。在SY5Y、FELIX和NB-1细胞系中，Lorlatinib也剂量依赖性地降低PLK1水平。

为验证PLK1抑制在Lorlatinib efficacy中的作用，研究将Crizotinib与PLK1抑制剂BI6727联合使用。在SY5Y和FELIX细胞系中，Crizotinib与BI6727联合处理使Crizotinib的效力增强约10倍，表明PLK1抑制在模拟Lorlatinib单药治疗的生长抑制中起关键作用。此外，Lorlatinib还在多种模型中显著降低AURKA蛋白水平，而Crizotinib的效果较弱。

Lorlatinib差异调控转录

RNA-seq分析显示，Lorlatinib在NB-1643 CDX和COG-N-453x PDX模型中诱导比Crizotinib更显著的转录组变化。 G2/M激酶，如PLK1、PLK4、AURKA、AURKB、MELK和PKMYT1，在Lorlatinib处理下显著下调。而Crizotinib在NB-1643中下调部分G2/M激酶，但在COG-N-453x中的效果较弱，这与先前关于ALK R1275突变肿瘤对Crizotinib transiently responsive的发现一致。

值得注意的是，ALK、PTK2、PTK2B、TNK2或FER的mRNA表达并未显著下降，表明这些激酶的减少是由于Lorlatinib直接结合导致的MIB displacement，而非转录下调。

细胞周期分析显示，Lorlatinib比Crizotinib更 robustly 地将细胞阻滞在G2/M期。此外，Lorlatinib下调BIRC5（survivin），增加γH2AX表达，诱导PARP切割和促凋亡蛋白Bim表达，表明其通过影响细胞周期和细胞死亡途径发挥抗肿瘤活性。

MYCN在G2/M细胞周期转换基因启动子上富集并在响应Lorlatinib时耗竭

激活的ALK已知与MYCN在神经母细胞瘤 tumorigenesis 中协作。 Crizotinib和Lorlatinib处理均导致NB-1643中MYCN表达减少，而Lorlatinib在COG-N-453x中的下调作用更显著。 Western blot分析证实，Lorlatinib在COG-N-453x肿瘤中更显著地下调MYCN蛋白水平。

利用已发表的MYCN ChIPseq数据，研究发现MYCN在PLK1、AURKA、AURKB、PLK4、CDK1和MELK等G2/M激酶的内源启动子上富集。 ChIP qPCR分析显示，Lorlatinib处理导致MYCN和RNA Pol II在这些基因启动子上的密度显著降低，表明Lorlatinib至少部分通过减少MYCN在这些关键基因启动子上的占据来发挥对细胞周期激酶的影响。

讨论

本研究通过化学蛋白质组学方法，揭示了Lorlatinib在ALK驱动神经母细胞瘤中卓越疗效的分子机制。 Lorlatinib不仅强效抑制ALK激酶活性，还直接靶向并抑制多种G2/M期激酶，如PLK1、AURKA等，并通过下调MYCN表达，协同诱导细胞周期阻滞和凋亡。这些发现阐明了Lorlatinib克服Crizotinib原发性耐药的新机制，为神经母细胞瘤的精准治疗提供了重要的理论依据。尽管G2/M激酶抑制剂如BI6727在体内研究中表现出毒性，但针对这些靶点的进一步研究和开发可能为神经母细胞瘤治疗提供新的组合策略。未来的工作应聚焦于Lorlatinib耐药机制的解析，以及其与标准化疗联合应用的临床潜力。