时空T细胞追踪技术推动儿童癌症个性化T细胞受体疗法设计

本研究通过深度单细胞T细胞受体（TCR）测序技术，追踪一例儿童恶性横纹肌样瘤（MRT）患者在接受免疫检查点抑制剂（ICI）治疗过程中的T细胞动态变化，揭示了肿瘤微环境（TME）与外周血中T细胞克隆的时空演化规律，并成功验证多个肿瘤反应性TCR克隆，为儿童低突变负荷肿瘤的免疫治疗策略和个体化TCR-T细胞疗法提供了关键理论与技术支撑。

　　

临床病程与样本采集

一名5个月大患儿因急性腹部膨隆就诊，磁共振成像显示其肾脏存在一大型浸润性肿块，经手术切除并经病理确诊为恶性横纹肌样瘤（MRT）。全基因组测序显示该肿瘤突变负荷极低（TMB = 0.11突变/Mb），但存在SMARCB1基因的双等位缺失，这是MRT的典型驱动事件。免疫组化结果显示肿瘤区域存在CD3⁺ T细胞浸润和PD-L1表达（部分区域>30%），提示可能对免疫治疗敏感。患儿在接受COG-AREN0321方案化疗及放疗基础上，联合使用atezolizumab（抗PD-L1抗体）治疗，最终达到完全缓解（CR）。治疗期间共采集肿瘤组织样本1次及外周血样本7个时间点，用于后续深度免疫分析。

T细胞谱揭示抗肿瘤免疫应答

通过单细胞RNA与TCR测序技术，对肿瘤微环境（TME）中的22,617个细胞进行解析，其中CD45⁺免疫细胞中包含14,789个T细胞。聚类分析识别出包括细胞毒性CD8⁺ T细胞、（前）耗竭态T细胞、调节性T细胞（Treg）、辅助T细胞（Th）以及增殖性T细胞等多个亚群。值得注意的是，多数CD8⁺ T细胞表现出IFNG高表达及耗竭相关标志物（如CXCL13、TNFRSF9），部分亚群还高表达ZNF683（Hobit），提示存在组织驻留记忆T细胞（T_RM）。TCR克隆分析显示，在TME中存在显著克隆扩增，尤其是在细胞毒性CD8⁺及Treg群体中。这些结果共同说明肿瘤内部存在活跃的T细胞免疫应答，但同时存在免疫抑制性微环境。

血液中抗肿瘤T细胞活性的克隆动态追踪

为进一步追踪治疗过程中系统免疫应答变化，研究采用高通量单细胞TCR测序（OS-T）技术对7个时间点外周血中的2,003,861个CD3⁺ T细胞进行分析。结果发现，在血液中可检测到来自TME的克隆（占TME扩增克隆的9.61%），但其在血液T细胞库中占比极低（0.4%），凸显出深度测序在低频克隆追踪中的必要性。早期时间点（T1）以Treg克隆为主，ICI治疗后（T2–T3）则转变为以CD8⁺ T细胞为主导，后期（T4–T7）则可见CD4⁺辅助T细胞克隆的持续存在，提示免疫应答从效应向记忆状态转变。研究还识别出19个在ICI治疗后显著扩增的T细胞克隆，包括既存克隆与新诱发克隆，其中5个与TME来源克隆重叠。绝大多数显著扩增克隆在12个月后仍可检测到，表明治疗诱导了持久性T细胞免疫记忆。

肿瘤反应性T细胞克隆的功能验证

为确认血液中T细胞的肿瘤反应性，研究将患儿外周血来源的T细胞与自体肿瘤细胞系共培养，并通过41BB（CD137）表达分选激活态T细胞进行单细胞测序。结果显示，41BB⁺细胞多为CD8⁺ T细胞，其基因表达特征与TME中的细胞毒性T细胞高度相似，且富集于已知的肿瘤反应性T细胞标志基因。进一步地，这些克隆在体内外均表现出对肿瘤细胞的特异性反应。

TCR工程化T细胞用于个性化细胞治疗

研究进一步从TME和血液中筛选出32个候选TCR克隆（11个来自TME，21个为ICI诱导克隆），通过mRNA转导方式将其导入Jurkat细胞或患儿自体T细胞中，验证其对肿瘤细胞的杀伤能力。结果显示，多数TME来源克隆（7/11）及部分血液来源克隆（3/21）均能特异性激活并杀伤肿瘤细胞。这一结果不仅验证了深度TCR测序在候选TCR筛选中的有效性，也表明血液可作为识别肿瘤反应性T细胞的替代来源。

讨论

本研究通过结合肿瘤组织与外周血的深度T细胞受体测序，成功描绘了一例儿童低突变负荷肿瘤在ICI治疗过程中的免疫动态变化，并验证了多个可用于TCR-T细胞疗法的候选受体。研究强调，儿童肿瘤由于其免疫系统的“未成熟”特性，肿瘤微环境中肿瘤反应性T细胞比例较高，且血液中ICI诱导克隆较易检测，这为儿童癌症的个体化细胞免疫治疗提供了新的思路与策略。研究还展示了mRNA瞬时转导在快速验证TCR功能及推进个体化T细胞治疗中的潜力，为将来临床转化研究奠定基础。