循环肿瘤DNA在早期乳腺癌局部区域复发预测中的突破性价值：一项概念验证研究

本综述深入探讨了循环肿瘤DNA（ctDNA）作为早期乳腺癌（EBC）局部区域复发（LRR）预测工具的前沿研究。通过肿瘤组织测序和数字化PCR（dPCR）技术，研究发现ctDNA可在临床诊断前28个月预警LRR，展现其高灵敏度（90%）和特异性（94%），为个体化监测和及时干预提供了新策略。

　　

背景

局部区域复发（LRR）是早期乳腺癌（EBC）患者在接受根治性治疗后随访过程中的主要临床挑战。尽管循环肿瘤DNA（ctDNA）已被证明能够预测远处转移，但其在LRR中的应用价值尚不明确。本研究通过一例具有明确LRR记录且可获得肿瘤和血浆样本的索引病例，分析了前瞻性III期芬维A胺预防试验的数据，旨在评估ctDNA在LRR早期检测中的潜力。

方法

研究基于一例乳腺癌索引病例和来自芬维A胺预防试验的合格患者。索引病例的临床病理数据、肿瘤组织测序和血浆样本分析在诊断时、LRR时及随访期间进行评估。试验患者入选标准包括：具有适用于下一代测序（NGS）的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或冷冻肿瘤组织，以及至少三个前瞻性收集的随访血浆样本。该试验纳入了30-70岁、T1-T2 N0期乳腺癌女性患者，接受手术±放疗，未进行辅助全身化疗或内分泌治疗。参与者每半年接受临床评估，每年进行乳腺X线摄影和胸部X光检查，每两年进行骨扫描。随访期间，每6个月收集一次血浆样本，直至复发。

肿瘤组织DNA提取与测序

从原发性肿瘤FFPE组织切片（厚度10μm，肿瘤细胞含量≥50%）中提取DNA，使用GeneRead DNA FFPE Kit（Qiagen）进行操作。冷冻样本使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen）提取DNA。DNA定量采用Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）。靶向NGS使用Ion AmpliSeq? Cancer Hotspot Panel v2（Thermo Fisher Scientific），覆盖50个癌基因和抑癌基因的207个扩增子。未检测到体细胞变异的病例，且具有匹配的来自正常淋巴结或乳腺组织的种系DNA，进一步使用Ion AmpliSeq? Comprehensive Cancer Panel（Thermo Fisher Scientific）进行分析，该面板靶向409个癌症相关基因的所有外显子。

血浆收集与细胞游离DNA提取

索引病例术前及随访期间采集血液，置于K2EDTA管中。芬维A胺队列使用肝素管采集基线、随访及复发前的血液。血浆通过离心分离，储存于-80°C。细胞游离DNA（cfDNA）使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen）提取，洗脱于35μL AVE缓冲液中，并通过Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）定量。肝素化样本的洗脱液使用肝素酶I（1u/μl）在室温下处理1小时。使用125 bp Lambda DNA片段的加标实验证实肝素酶处理后dPCR性能良好。

数字化聚合酶链反应（dPCR）

使用TaqMan SNP Genotyping（Thermo Fisher）开发dPCR assays，以验证肿瘤组织中的体细胞变异并在血浆中追踪它们。当缺乏湿实验室验证的dPCR assays时，使用Thermo Fisher Scientific定制SNP基因分型assay工具设计突变特异性dPCR assays。PCR反应在ProFlex? 2x Flat PCR System热循环仪上运行，芯片在96°C孵育10分钟，随后进行45个循环：56°C 2分钟、98°C 30秒、60°C 2分钟。芯片在QuantStudio? 3D Digital PCR Instrument上读取，并通过QuantStudio? 3D AnalysisSuite? Server分析。每次运行均包含野生型基因组和無模板对照（NTC）作为阴性对照。

血浆DNA预扩增

使用TaqMan? PreAmp Master Mix Kit（Thermo Fisher Scientific）对血浆DNA进行预富集扩增。样本体积通过Eppendorf Concentrator 5301减少至14μl。预扩增反应体积为10μl，包含4μl DNA模板、5μl预扩增主混合物和1μl相同特异性引物和探针（最终稀释度为0.05x）。扩增反应在95°C孵育10分钟后，进行12个循环：95°C 15秒、60°C 4分钟。预扩增PCR产物稀释1:100-1:500，取7μl稀释液进行dPCR。每次预扩增反应均包含野生型基因组和NTC作为阴性对照，并通过dPCR检测。有或无预扩增的dPCR估计的变异等位基因频率（VAF）显示出强线性相关性，r2=0.96，表明预扩增不影响VAF评估。

结果

索引病例展示

一名37岁绝经前女性，无乳腺癌或卵巢癌家族史，确认种系BRCA1和BRCA2野生型，因左乳腺肿瘤切除术后转诊至本院。体格检查显示左乳腺手术疤痕愈合良好，左腋窝可触及直径约1cm的淋巴结。乳腺X线摄影和超声显示左腋窝淋巴结增生且可疑。患者在初次手术后5周接受左外上象限切除术和腋窝淋巴结清扫。最终手术标本组织学检查显示浸润性乳腺癌III级，最大径18mm（pT1c），30个腋窝淋巴结中15个有转移（pN3）。免疫组化雌激素受体（ER）、孕激素受体（PgR）和HER2阴性，符合三阴性表型；Ki-67增殖指数为90%。辅助化疗采用多柔比星和紫杉醇（AT方案）每21天4个周期，随后环磷酰胺、甲氨蝶呤和氟尿嘧啶（CMF）每28天第1和第8天给药4个周期。患者完成治疗，无重大并发症。初次手术后约一年，患者原发肿瘤部位出现局部复发。影像学检查确认无远处转移。患者接受根治性乳房切除术。组织学评估确认三阴性LRR，最大径至少1.7cm（rpT1c）。术后患者接受卡铂和吉西他滨第1和第8天给药每21天6个周期，随后辅助放疗至胸壁和锁骨上淋巴结，总剂量50.4Gy，分28次每日1.8Gy。患者持续常规随访，截至2024年6月最新随访，临床检查和影像学检查显示无局部、区域或远处疾病复发证据。

肿瘤靶向NGS鉴定出多个体细胞变异， specifically TP53（c.586C>T, p.R196, VAF 29%）、SMARCB1（c.215C>A, p.T72K, VAF 38%）和PTEN（c.203A>G, p.Y68C, VAF 8%）。其中，仅TP53 p.R196突变在原发性肿瘤和LRR中均被检测到，因此被选择用于后续血浆分析。SMARCB1和PTEN突变在复发灶中未检测到，未在血浆样本中评估。TP53 p.R196*突变通过dPCR在两个病灶中确认，包括复发肿瘤，其VAF为58%。此外，该突变在原发性手术和LRR手术前的血浆样本中均被检测到，VAF分别为0.19%和0.12%。值得注意的是，在随访期间前瞻性收集的所有五个样本中，该突变均不可检测，与患者无复发情况一致。

试验队列中的ctDNA监测

基于这些结果，我们报告了前瞻性III期芬维A胺预防试验 enrolled 患者的事后分析。共40例患者符合上述预设标准（图2）。尽管DNA从超过20年历史的标本中提取，40例分析患者中27例（67.5%）的肿瘤样本中鉴定出一个或多个适用于ctDNA追踪的体细胞变异，从而能够开发肿瘤知情dPCR assays用于血浆分析。研究患者、肿瘤和治疗特征总结于表1。

通过NGS共发现34个肿瘤突变并经dPCR验证：23例患者有1个突变（85%），3例有2个（11%），1例有3个（4%）。最常突变的基因是PIK3CA（17/34, 50%）、TP53（8/34, 23.5%）和PTEN（2/34, 5.9%）。NGS和dPCR估计的VAF显示出强线性相关性，r2=0.90。验证突变详情见补充表S1。

通过dPCR分析了112个血浆样本中已识别肿瘤突变。在复发患者中，6例LRR和4例远处转移，除一例外，所有病例在临床诊断时均可检测到ctDNA，VAF值范围0.113至4.69（图3、4、补充图S2）。与临床复发相比，ctDNA在临床诊断前的检测在LRR和远处复发中均观察到，LRR的中位提前时间为24.5个月（IQR: 17.9-27.9），转移性疾病为12.25个月（IQR: 7.4-22.8）。在患者#2、#7和#8中，LRR最终 followed by 转移（补充表S2）。由于协议在初始事件后停止血浆采样，ctDNA监测直至进展被排除。

在17例无临床复发证据的患者中，除患者#19在三个连续样本中显示ctDNA但在最后一次采样中转为阴性外，所有67个样本中均未检测到ctDNA。无 documented 临床乳腺复发。该患者最后一次采血后52天死亡，享年79岁。即使考虑有限病例数，ctDNA显示出总体准确性92%（95% CI: 75-99），灵敏度90%（95% CI: 55-99），特异性94%（95% CI: 71-99）（补充表S3）。

讨论

早期乳腺癌（EBC）患者术后血浆样本中的肿瘤特异性突变可作为检测局部区域复发（LRR）的监测工具。在索引病例中，原发性和LRR共享的TP53突变在诊断时和复发时的血浆中均被检测到，但在随访期间不可检测，与患者无病状态一致。在一项预防试验队列中，ctDNA不仅识别了LRR，而且 anticipated 其临床诊断。

这些发现扩展了支持ctDNA用于乳腺癌管理潜在应用的证据，补充了其在预测远处复发方面的既定作用。尽管先前研究侧重于晚期疾病监测或治疗反应，但 recent 进展表明我们应重新考虑ctDNA的全部潜力。除了单纯检测复发，ctDNA可以评估手术疗效、识别残留疾病并监测缓解期间的演变，作为指导个性化护理贯穿治疗连续体的动态生物标志物。我们 earlier 研究在导管原位癌患者血液中检测到原发性肿瘤突变，进一步 reinforced ctDNA分析 across 所有乳腺癌分期的潜力，从 pre-invasive 到复发性疾病。

乳腺癌LRR的早期诊断仍然是治疗后管理的基石， given 其 critical 对预后和治疗策略的影响。LRR不仅信号潜在治疗失败，而且可能先于远处转移， thereby 影响无病生存和总生存。保乳治疗后的传统 mammographic 监测旨在检测同侧复发和对侧乳腺癌，其年风险分别为0.2-2%和0.4%。

尽管在前三至五年通常进行年度诊断性乳腺X线摄影以识别残留或复发性疾病并建立可靠的治疗后基线，但关于其最佳频率、方法和生存获益的高质量证据仍然有限。尽管如此，回顾性研究表明 mammographically 检测到的复发具有生存优势， despite 在有乳腺癌个人史女性中观察到的较低灵敏度和特异性。

因此，ctDNA具有通过整合影像学和分子工具以优化乳腺癌幸存者LRR早期检测和管理的潜力，协助诊断仍处于 potentially 可治愈状态的LRR。

此外，我们观察到ctDNA阴性患者保持无复发，支持基于个体风险的影像评估个性化。我们必须认识到，一例患者（17例中）具有可检测ctDNA但随访期间未发生明显复发。尽管患者#19有假阳性结果， given 缺乏复发和随后ctDNA清除，这是研究人群中唯一 such 病例，ctDNA显示出高阳性预测值90%（95% CI: 57-98%）和 similarly 高阴性预测值94%（95% CI: 73-99%）。该患者最后一次采血后52天死亡。不幸的是，通过可能 means 收集死因的进一步临床信息 attempts 未成功。因此，我们不能排除未诊断恶性肿瘤、亚临床疾病或其他无关原因的可能性。这些发现 underscore 在开发新ctDNA assays 时保持高特异性的重要性， both 防止假阳性结果导致不必要的心理困扰 and 解决技术挑战，如可能与无效红细胞生成相关的背景信号。

值得注意的是，在当前临床实践中，国际指南推荐在晚期乳腺癌中合理使用NGS，优先针对已知可操作突变（例如PIK3CA、BRCA1/2、ESR1等）进行靶向测试。相反，对于局部性疾病术后微小残留疾病评估尚非标准实践，应限于 enrolled 临床研究方案的患者。

研究表明，术后ctDNA检测可以预测乳腺癌早期复发和较差预后，中位提前时间在临床复发前7.9至18.9个月。这些研究大多数使用肿瘤知情方法评估ctDNA，通常通过数字化PCR，如本研究，或使用 assays 如 Signatera，提供高灵敏度，检测限0.01%。最近，出现了新的ctDNA分析方法。Invitae PCM追踪18-50个肿瘤特异性变异，在13例复发患者中10例检测到ctDNA，中位提前时间13.7个月，无复发患者中无假阳性。NeXT Personal结合全基因组测序 based 肿瘤知情面板和固定 clinically 相关变异面板，允许追踪 up to 1,800个肿瘤特异性突变，检测限低至1百万分之一， reported 复发提前时间11.7个月。

我们的研究通过 specifically 聚焦ctDNA预测局部区域复发的潜力，为这一扩展领域做出贡献，这一方面至今受到有限关注。我们工作的优势在于使用明确 enrolled 前瞻性临床试验的患者群体，该试验 designed 评估局部区域复发，为分析此背景下ctDNA动力学提供了稳健框架。此外，我们的发现 strengthen 使用ctDNA早期检测疾病并 sooner initiate 治疗的案例， particularly 当复发仍然 localized 且因此 amenable 以治愈为目的的治疗。尽管本研究 findings 推进了对ctDNA在LRR检测中潜力的理解，但必须承认 several 局限性。研究样本量相对较小，使用历史组织和血浆样本可能影响我们结果在当代临床环境中的适用性，以及术后采血时间可变可能影响复发/进展 anticipation 评估。此外，在五例病例中从冷冻复发组织标本提取DNA代表技术局限性。然而，随着直接血浆测序技术持续 evolve 和检测限 increase，肿瘤知情方法可能 eventually 被补充，或甚至 replaced by 直接、肿瘤不可知论ctDNA分析， particularly 在组织不可用或存档材料次优的背景下。未来调查应包括前瞻性临床试验以确定ctDNA引导干预是否改善患者管理。关于最佳采样频率和定量ctDNA随时间监测的临床效用，关键问题仍然存在。

结论

我们的 findings 表明，ctDNA代表了一种有前景的工具，用于检测早期乳腺癌（EBC）根治性治疗后局部区域复发（LRR）。本研究的优势包括使用高灵敏度、肿瘤知情数字化PCR技术；可获得 enrolled 专门 designed 监测第二原发性乳腺癌研究队列的样本；以及存在多个前瞻性收集的纵向血浆样本。此外，ctDNA分析在定期接受乳腺成像作为研究方案一部分的患者中回顾性进行， thereby 最小化历史上影响转移背景下ctDNA研究的混淆偏倚，其中成像 often 不规则。尽管如此，必须承认 several 局限性， particularly 检测到的VAF frequently 低于0.2%，突出需要增强直接分析 assays 的灵敏度和特异性，以使ctDNA评估 sufficiently 实用用于广泛常规临床应用。独立研究的进一步确认将 essential 以 corroborate 这些发现并支持将ctDNA分析整合入早期乳腺癌治疗患者的 multidisciplinary 管理。