Semaglutide与Tirzepatide对高脂高果糖饮食小鼠棕色脂肪代谢及炎症基因表达的差异性调控作用研究

本综述系统比较了GLP-1受体激动剂Semaglutide与双重GIP/GLP-1受体激动剂Tirzepatide在高脂高果糖饮食（HFHFD）诱导肥胖小鼠模型中棕色脂肪组织（BAT）的转录组调控差异。研究发现二者均能通过调控Cyp1a1、Hsd11b1、Atp1a3等共同靶点改善胰岛素敏感性和代谢稳态，而Tirzepatide独特下调Il1b、Ptger4等炎症相关基因，提示其更强的抗炎和代谢调节潜力，为BAT靶向治疗代谢性疾病提供了新机制见解。

　　

引言

肥胖作为典型的生活方式相关疾病，已演变为威胁全球公共健康的流行病。世界卫生组织数据显示，自1990年以来全球成人肥胖率增长超过一倍，青少年肥胖率增长近三倍。肥胖显著增加2型糖尿病和心血管疾病等慢性病风险，其发生与遗传因素和环境因素（尤其是不健康饮食习惯）密切相关。

肠促胰岛素是一类由肠道分泌的肽类激素，主要包括葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）。GIP受体（GIPR）广泛表达于胰腺、脑、骨和脂肪组织，而GLP-1受体（GLP-1R）主要分布于胰腺、脑、胃、肝脏和心脏。Semaglutide作为选择性GLP-1受体激动剂，已获多国批准用于2型糖尿病（T2DM）和肥胖的临床管理，能有效减轻体重、优化葡萄糖稳态、增强胰岛素敏感性并带来心血管和肾脏获益。Tirzepatide是近期备受关注的双重GIP和GLP-1受体激动剂，在肥胖糖尿病（db/db）小鼠模型中表现出比Semaglutide更好的血糖控制、β细胞功能保护以及更显著的肝脏脂肪变性和炎症减轻作用。临床2期（GPWB）和3期（SURPASS 1-5）试验也证实Tirzepatide在血糖控制、体重减轻和胰腺胰岛素输出方面优于Semaglutide。

棕色脂肪组织（BAT）在功能上不同于主要作为脂质储存场所的白色脂肪组织（WAT），其通过解耦联蛋白1（UCP1）驱动一种特殊的非颤抖性产热形式，直接将化学能转化为热能。研究表明，冷暴露激活BAT可增强血浆甘油三酯（TG）清除、改善高胆固醇血症并增加葡萄糖摄取。人体中BAT活性与体重指数（BMI）呈负相关，更重要的是，BAT被认为是贡献全身能量稳态的代谢活跃器官。越来越多证据表明，刺激BAT活性或促进WAT褐变对葡萄糖和脂质代谢产生有利影响。

尽管BAP参与能量稳态，但其确切作用和治疗潜力仍缺乏确凿的机制证据支持。既往研究显示，Semaglutide增强BAT代谢活性并促进WAT褐变，从而增加整体能量消耗。Samms等人证明Tirzepatide改善全身胰岛素敏感性的作用独立于体重减轻，通过高胰岛素-正常血糖钳夹研究以及转录组和代谢组分析表明，该效应与BAT中葡萄糖、脂质和支链氨基酸（BCAA）代谢途径的激活相关。然而，关于Semaglutide和Tirzepatide对BAT转录组调控效应的头对头比较研究仍不足，BAP是否显著贡献于肠促胰岛素疗法的代谢益处尚不清楚。

因此，本研究旨在探究和比较Semaglutide和Tirzepatide在HFHFD喂养小鼠BAT中的转录组变化，以阐明它们的转录调控机制，并评估BAT是否代表代谢性疾病的新治疗靶点。

材料与方法

试剂与动物

Tirzepatide（美国礼来公司）和Semaglutide（丹麦诺和诺德公司）购自各自制造商。28只雄性C57BL/6J小鼠（7周龄；20±2克）在标准化条件（24±1°C，12小时光/暗循环）下饲养，自由获取常规饲料和水。研究协议经河北医科大学附属河北省人民医院伦理委员会审查批准（批准号：2025-DW-002）。

实验设计

小鼠适应性喂养一周后，随机分为HFHFD诱导肥胖模型组（n=21）和对照组（n=7）。模型组小鼠接受HFHFD（M18101801：40%脂肪、34.5%果糖、20%蛋白质和2%胆固醇；中国四川百奥派生物技术），对照组饲喂标准饲料（D12450B：10%脂肪、20%蛋白质和70%碳水化合物；美国Research Diets, Inc.）。饮食干预持续7周，期间每周测量体重。

在7周喂养期结束时，小鼠禁食8小时后进行腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）。小鼠按2克/千克体重剂量腹腔注射50%葡萄糖溶液，在注射后0、15、30、60和120分钟从尾静脉血测量血糖浓度，使用ACCU-CHEK Performa血糖仪（德国罗氏诊断有限公司）检测。计算曲线下面积（AUC）以评估葡萄糖耐量。

肥胖诱导后，模型小鼠（n=21）随机分为三个干预组（每组n=7）：Semaglutide组、Tirzepatide组和生理盐水对照组。每组接受皮下注射Semaglutide（30纳摩尔/千克）、Tirzepatide（10纳摩尔/千克）或等体积生理盐水，每3天一次，持续7周。剂量选择基于已建立的饮食诱导肥胖C57BL6小鼠临床前研究，Semaglutide 30纳摩尔/千克被广泛用于实现持续体重减轻和血糖改善，而Tirzepatide 10纳摩尔/千克由于其更高效力和双重GIP/GLP-1受体激动作用，被验证可产生相当或更大的代谢益处。

在整个干预时间线中每周跟踪体重。完成所有16次药物给药后，小鼠按照与第一次测试相同的方案进行第二次IPGTT以评估葡萄糖代谢，并相应计算AUC。实验结束时，小鼠用1%戊巴比妥钠（60毫克/千克；中国国药集团化学试剂有限公司）腹腔麻醉，并通过颈椎脱位法安乐死。通过眶后采血收集血样，并采集肩胛间BAT和肝组织用于后续分析。

生化检测

血样经离心（3,000转/分钟，15分钟，4°C）后，血清保存于-80°C直至分析。使用小鼠超灵敏胰岛素ELISA试剂盒（美国ALPCO；80-INSMSU-E01）测量血清胰岛素水平。使用商业检测试剂盒（中国南京建成生物工程研究所；A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1、A113-1-1）定量血清TG、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。

对于肝脏TG测量，约50毫克肝组织在冰上用机械匀浆器与九体积缓冲液（w/v=1:9，克:毫升）匀浆。匀浆液离心（2,500转/分钟，10分钟，4°C），上清液用于TG定量，使用商业试剂盒（中国南京建成生物工程研究所；A110-1-1）。在500纳米波长下用酶标仪（中国赛默飞世尔科技Multiskan FC）测量吸光度，肝TG水平归一化至组织重量，表示为毫摩尔/克组织。

组织学分析

对于苏木精和伊红（H&E）染色，BAT组织浸泡在10%中性缓冲福尔马林中固定，随后依次进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡包埋。石蜡包埋的BAT组织切成5微米切片，脱蜡、复水，并按照标准方案用H&E染色。脱水并封片后，在200倍放大倍数下用光学显微镜检查组织形态。对于油红O（ORO）染色，BAT样本快速冷冻、冰冻切片，并用4%多聚甲醛固定。组织切片用ORO染色以可视化脂滴，随后分化、苏木精复染、冲洗和封片。基于显微图像使用Aipathwell软件（中国武汉赛维尔生物）定量分析脂滴面积。

转录组分析

RNA提取与文库制备

用TRIzol试剂（美国Invitrogen）提取BAT RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计（美国赛默飞世尔科技）评估RNA量和纯度，使用Agilent 2100 Bioanalyzer（美国安捷伦科技）评估RNA完整性。使用VAHTS Universal V5 RNA Library Prep Kit（中国南京诺唯赞生物科技股份有限公司）完成RNA测序文库构建。

转录组数据处理与生物信息学分析

使用Illumina NovaSeq 6000平台（美国Illumina）进行测序，产生150 bp双端读段。使用fastp（v0.20.1；中国深圳HaploX Biotechnology）对原始FASTQ读段进行接头修剪和质量过滤，获得高质量清洁读段。清洁读段通过HISAT2（v2.1.0；美国约翰霍普金斯大学）比对到GRCm38/mm10小鼠参考基因组。使用FPKM量化基因表达，并应用HTSeq-count（v0.11.2；德国欧洲分子生物学实验室）生成基因水平读段计数。

在R（v3.2.0；奥地利R统计计算基金会）中进行主成分分析（PCA）以评估组间一致性和聚类模式。基于DESeq2（v1.22.2；德国欧洲分子生物学实验室）分析，将错误发现率（q值）低于0.05且绝对log?倍数变化大于1的基因归类为差异表达基因（DEG）。通过火山图可视化DEG以突出显著上调和下调基因。层次聚类和热图分析说明各组间的表达模式。生成维恩图以识别比较组之间重叠的DEG。

使用R中的clusterProfiler（v4.6.0；中国香港大学）进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，通过超几何检验（p<0.05）确定显著性。在R中生成描绘基因比和显著性水平的气泡图。使用STRING数据库（v11.0；瑞士瑞士生物信息学研究所和英国欧洲生物信息学研究所）对前30个DEG进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，并构建所得相互作用网络以识别关键调控途径中的枢纽基因。

DEG的RT-qPCR验证程序

为验证RNA-seq鉴定的与炎症和脂质代谢相关的基因，进行RT-qPCR分析。使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix with gDNA Remover（中国北京TransGen Biotech；AT341-02）将总RNA（0.5微克）反转录成cDNA。反转录步骤在42°C进行15分钟，随后在85°C酶灭活5秒。使用PerfectStart? Green qPCR SuperMix（中国北京TransGen Biotech；AQ601）在Roche LightCycler 480 II系统（瑞士罗氏诊断）上进行定量PCR。每个10微升反应包含稀释的cDNA、2×SuperMix、基因特异性引物（中国上海OE Biotech Co., Ltd.）和无核酸酶水。目标基因的引物序列提供在补充表S1中。热循环方案包括94°C初始变性30秒，随后45个循环的94°C 5秒和60°C 30秒。从60°C到97°C进行熔解曲线分析。相对基因表达归一化至GAPDH，并使用2^?ΔΔCt方法计算。

统计分析

使用SPSS（version 27.0；美国IBM Corp.）和GraphPad Prism（version 9.5；美国GraphPad Software）进行统计分析。结果表示为平均值±标准差（SD）。根据数据分布和组结构，使用独立样本t检验、单因素方差分析（ANOVA）或双因素ANOVA进行统计比较。采用p<0.05的阈值表示统计显著性。

结果

HFHFD诱导小鼠显著体重增加和葡萄糖不耐受

经过7周饮食干预后，接受HFHFD的动物体重（30.97±1.07克）显著高于标准饲料喂养的对照组（28.30±1.20克；p<0.001）。腹腔注射葡萄糖后，HFHFD喂养小鼠在30、60和120分钟的血糖浓度显著高于对照组（p<0.001）。AUC分析进一步显示HFHFD组葡萄糖清除受损（1,975±165.9 vs. 1,379±207.1毫摩尔/升×分钟；p<0.001），证实了葡萄糖不耐受的发展。

Semaglutide和Tirzepatide对体重和葡萄糖稳态的影响

给予Semaglutide或Tirzepatide后，小鼠体重显著低于生理盐水组（生理盐水：35.61±3.03克；Semaglutide：30.50±0.89克；Tirzepatide：30.39±1.06克；p<0.001），分别减少约14.35%和14.66%。葡萄糖负荷后，Semaglutide（p<0.01）和Tirzepatide组（p<0.001）在30和60分钟的血糖水平显著低于生理盐水组。值得注意的是，在30分钟时间点，给予Tirzepatide的小鼠血糖浓度（12.67±1.53毫摩尔/升）显著低于接受Semaglutide的小鼠（17.57±2.31毫摩尔/升；p<0.001）。AUC分析表明，生理盐水处理小鼠相对于所有其他干预组葡萄糖清除受损。此外，Tirzepatide给药导致比Semaglutide更低的AUC值（1,132±115.7 vs. 1,492±113.2毫摩尔/升×分钟），尽管差异未达到统计显著性。

药物干预对脂质代谢和胰岛素敏感性的影响

生理盐水组血清胰岛素浓度（37.21±2.83 mIU/mL）显著高于对照组（28.65±4.18 mIU/mL；p<0.01）、Semaglutide组（27.87±4.03 mIU/mL；p<0.01）和Tirzepatide组（27.2±4.59 mIU/mL；p<0.001），表明药物干预后胰岛素敏感性改善。类似地，Semaglutide组（0.38±0.11毫摩尔/升；p<0.01）和Tirzepatide组（0.33±0.06毫摩尔/升；p<0.01）血清TG浓度显著低于生理盐水处理组（0.65±0.10毫摩尔/升）。与生理盐水处理组（0.026±0.0049毫摩尔/克肝脏）相比，对照组（0.015±0.0031毫摩尔/克肝脏；p<0.001）、Semaglutide组（0.021±0.0033毫摩尔/克肝脏；p<0.05）和Tirzepatide组（0.018±0.0036毫摩尔/克肝脏；p<0.01）肝TG积累显著减少。出乎意料的是，生理盐水组血清TG浓度低于对照动物（0.95±0.23毫摩尔/升；p<0.01）。先前研究已报道类似发现，在这些研究中，喂食胆碱缺乏L-氨基酸定义高脂饮食（CDAHFD）或常规高脂饮食（HFD）的C57BL/6J小鼠尽管肝TG积累增加和更严重的肝脂肪变性，但血清TG水平低于标准饲料喂养小鼠。这种血清TG的矛盾减少与肝TG积累同时发生，表明代谢失衡状态。这种效应可能归因于微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP）的下调，MTP是极低密度脂蛋白（VLDL）组装和肝TG输出的关键调节因子。

TC浓度在生理盐水组（4.28±0.82毫摩尔/升）显著高于Semaglutide组（2.86±0.36毫摩尔/升；p<0.001）和Tirzepatide组（2.72±0.57毫摩尔/升；p<0.001）。与生理盐水组（1.66±0.31毫摩尔/升）相比，对照组（2.61±0.38毫摩尔/升；p<0.001）和Tirzepatide组（2.39±0.52毫摩尔/升；p<0.01）HDL-C水平显著降低。相反，Semaglutide组HDL-C水平（2.20±0.21毫摩尔/升）呈现非显著上升趋势（p>0.05）。LDL-C水平在生理盐水组（0.54±0.08毫摩尔/升）显著高于对照组（0.31±0.10毫摩尔/升；p<0.001）、Semaglutide组（0.38±0.06毫摩尔/升；p<0.01）和Tirzepatide组（0.21±0.07毫摩尔/升；p<0.001）。值得注意的是，Tirzepatide降低LDL-C水平比Semaglutide更有效（p<0.01）。这些结果表明，Semaglutide和Tirzepatide均能改善HFHFD喂养小鼠的脂质代谢异常，且Tirzepatide发挥比Semaglutide更显著的降脂作用。

药物干预后BAT的组织学评估

H&E染色显示，BAT中脂滴在光学显微镜下呈现为大小不均的圆形或椭圆形空泡。与生理盐水组相比，对照组、Semaglutide组和Tirzepatide组脂滴更小，表明BAT中脂质积累减少。ORO染色显示细胞质内脂滴均匀染成红色，表明细胞内脂质积累。对照组、Semaglutide和Tirzepatide处理减小了脂滴大小，并减少了相对于生理盐水给药的ORO阳性染色区域。Tirzepatide（55.81±2.09%；p<0.05）和对照处理（48.45±7.07%；p<0.01）显著降低了ORO阳性面积比，与生理盐水组（67.68±4.57%）相比。尽管Semaglutide组（63.56±0.81%）也显示相对于生理盐水组下降趋势，但该差异无统计学意义（p>0.05）。这些发现表明，Semaglutide和Tirzepatide可能改善BAT中的脂质代谢异常。

转录组分析和DEG鉴定

进行RNA-Seq以评估BAT中的mRNA表达谱，并研究四组间的转录变化。分析显示，与对照组相比，生理盐水组58个基因表达增加，108个基因表达减少。与生理盐水组相比，Semaglutide给药导致467个DEG，包括268个上调和199个下调。相反，Tirzepatide给药产生40个DEG（20个上调和20个下调）。

维恩图分析确定了三个两两比较共有的8个DEG。这些基因可能参与HFHFD诱导代谢功能障碍和Semaglutide与Tirzepatide治疗作用的共享调控途径。此外，Semaglutide和Tirzepatide干预分别导致418和18个独特DEG，强调了不同的转录反应和可能不同的潜在机制。总共34个DEG在Semaglutide和Tirzepatide组之间重叠，表明两种药物可能共享特定调控途径或治疗靶点。这些结果强调了HFHFD驱动病理生理学与药物介导转录组调控之间的复杂关系。虽然共享DEG可能作为核心治疗靶点，但药物特异性DEG可能代表每种药物独特调控谱的分子特征。

PCA显示了对照组、生理盐水组、Semaglutide组和Tirzepatide组之间不同的转录谱和清晰的组分离，强调了HFHFD和药物干预的转录组影响。火山图和层次聚类热图说明了四组间不同的DEG分布和基因表达谱，表明条件特异性转录特征。与对照组相比，生理盐水组几个基因显著上调，包括Pon1、Cyp1a1、Il1b、Egr2、Ryr2、Tfrc和Ptger4。这些基因可能参与HFHFD诱导的病理生理过程，如炎症、氧化应激和代谢紊乱。相反，一组基因——包括Hsd11b1、Camk2b、Aacs和Atp1a3——显著下调，表明其相关生物学功能活性降低或抑制。相对于生理盐水处理，Semaglutide给药导致Atp1a3、Cyp1a1和Hsd11b1表达增加，而Zbtb16和Ryr2被抑制。在Tirzepatide组，与生理盐水组相比，Atp1a3、Cyp1a1、Hsd11b1和Tfrc上调，而Il1b、Ptger4和Tiam1下调。

GO和KEGG途径富集分析

GO富集分析表明，DEG在生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）中显著过度呈现，表明在多个细胞水平具有功能相关性。在HFHFD干预后的BAT中，DEG主要涉及脂质代谢、脂肪酸代谢过程和脂质生物合成等BP，这些与BAT能量稳态密切相关。这些结果表明HFHFD条件下BAT潜在代谢重塑，强调脂质处理途径。在Semaglutide组，DEG主要涉及脂质代谢、脂肪酸氧化、ATP生物合成和氧化还原酶活性。这种富集表明Semaglutide可能增强BAT中脂质利用和能量生产，贡献于其代谢益处。相反，Tirzepatide组DEG主要富集于中性粒细胞外渗阳性调控、氧化还原酶活性和NF-κB结合。这些发现暗示Tirzepatide可能发挥免疫调节和抗炎效应 alongside 代谢调控，可能贡献于改善代谢稳态。

KEGG途径分析揭示了实验组间差异表达mRNA的明显富集谱。与对照组相比，生理盐水组显示多个代谢和信号途径显著富集——如PPAR信号、脂肪酸延长、类固醇生物合成和AMPK信号。这种富集表明HFHFD暴露后能量代谢、炎症信号和凋亡过程显著变化。在Semaglutide组，DEG主要富集于涉及炎症反应、代谢控制和疾病相关信号的途径，暗示Semaglutide可能贡献于免疫调节和代谢平衡维持。Tirzepatide相关DEG显示脂质和能量代谢、糖酵解过程和胰岛素信号途径显著富集，支持其在恢复代谢稳态和改善全身能量调控中的潜在作用。

PPI网络分析

通过STRING构建的PPI网络揭示了DEG之间的功能相互作用，使得能够优先考虑关键调控候选物。在Semaglutide组，与生理盐水相比，从前30个DEG生成的PPI网络突出了几个高度连接的蛋白质，包括Ins、Il6、Lep和Pparg。这些节点展示了与其他蛋白质的广泛相互作用，暗示它们参与调节代谢过程，如血糖控制、脂质处理、胰岛素相关级联和炎症信号。在Tirzepatide组，PPI网络揭示了与生理盐水组相比Tfrc、Hsd11b1、Cyp1a1、Camk2b和Gdf5的上调，以及Ptger4和Il1b的下调。值得注意的是，Il1b被鉴定为一个高度连接的候选基因，无论是在网络度还是其充分记录的代谢和炎症调控作用方面，表明它可能在相关信号途径中扮演重要角色。这些相互作用表明该网络参与炎症和代谢控制的关键调控途径。

转录组结果的RT-qPCR验证

RT-qPCR分析验证了RNA-seq数据的可靠性，显示了两种方法之间基因表达的一致趋势。与生理盐水组相比，Semaglutide给药导致Cyp1a1（1.69±0.96 vs. 1.00±0.46）、Hsd11b1（1.43±0.66 vs. 1.00±0.28）和Atp1a3（4.00±1.05 vs. 1.00±0.16；p<0.01）上调。类似地，Tirzepatide处理诱导Cyp1a1（2.49±1.09）、Hsd11b1（1.60±0.43）和Atp1a3（3.22±0.90；p<0.01）相对于生理盐水呈上升趋势。与生理盐水相比，Tirzepatide还上调了Tfrc（1.94±0.39 vs. 1.00±0.22；p<0.05），同时下调了Il1b（0.32±0.13 vs. 1.00±0.75）和Ptger4（0.29±0.07 vs. 1.00±0.38；p<0.01）。相关性分析显示了RNA-seq和RT-qPCR结果之间的强一致性，Semaglutide与生理盐水比较的R²=0.8438，Tirzepatide与生理盐水比较的R²=0.9919。这些发现表明，Semaglutide和Tirzepatide均通过调节与代谢和能量平衡相关的基因表达来改善HFHFD诱导的代谢功能障碍。此外，除了代谢调控，Tirzepatide似乎对免疫相关基因产生额外效应，可能贡献于进一步改善肥胖表型——这种效应可能部分解释其相对于Semaglutide的优势。

讨论

在本研究中，我们观察到Semaglutide和Tirzepatide治疗组之间BAT中DEG数量存在显著差异，尽管Tirzepatide表现出更好的药效学功效，如更大的体重减轻、改善的血糖控制和增强的胰岛素敏感性所证明。这种差异可能归因于多个相互关联的因素。

首先，DEG计数的差异不应被解释为药理学效力差异的直接反映。转录组变化程度不一定对应于代谢改善程度。尽管两种药物都作为GLP-1受体激动剂，但Tirzepatide是一种不平衡的双重GLP-1/GIP受体激动剂，对GIP受体具有更高亲和力。尽管以较低剂量给药并诱导更少DEG，Tirzepatide强健地激活了关键代谢途径，表明它可能通过精确调节有限