坦桑尼亚不同疟疾传播强度地区人群中对恶性疟原虫传播阻断靶蛋白Pfs230D1M和Pfs48/45抗体的血清阳性率分析

本综述系统探讨了坦桑尼亚不同疟疾传播强度地区人群中针对恶性疟原虫传播阻断靶蛋白Pfs230D1M和Pfs48/45的抗体血清阳性率及其功能活性。研究发现自然获得的抗体反应普遍存在且稳定性高，成人血清阳性率显著高于儿童，其中约30%参与者同时对两种抗原呈阳性。通过标准膜饲喂实验（SMFA）证实，部分高反应性样本具有显著传播阻断活性（TRA）。该研究为传播阻断疫苗（TBV）的临床评估提供了重要基线数据，表明半免疫人群可能是评估TBV候选疫苗的理想群体。

　　

引言

疟疾仍然是全球重大的公共卫生负担，尤其在撒哈拉以南非洲地区。坦桑尼亚占全球疟疾死亡人数的4%，其国家疟疾战略计划旨在2025年将中高风险地区的疟疾患病率从15%降至7.5%以下，并在低流行地区将恶性疟原虫寄生虫率（pfpr）进一步降至0.5%以下。尽管现有的控制方法已显著降低疟疾发病率和死亡率，但进展放缓，因此需要不受当前媒介控制工具限制的新型工具。疟疾疫苗接种是一种有前景的新工具，对疾病负担和消除具有可持续影响。已获许可的疟疾疫苗R21/Matrix-M和RTS,S/AS01旨在靶向人类宿主中的恶性疟原虫肝脏阶段。然而，疟原虫具有复杂的生活史，涉及人类宿主和雌性按蚊体内的阶段。因此，需要能够靶向寄生虫生活史其他阶段的干预措施。传播阻断疫苗（TBV）提供了一种独特的方法，可中断疟疾寄生虫在蚊子体内的发育，并可能补充现有干预措施以控制和消除疟疾。

疟疾传播发生在雌性按蚊在血餐期间摄入至少一个雄性和一个雌性配子体时。配子体和配子在蚊子中肠内从红细胞中逸出，并在其表面表达特定蛋白质。这些表面蛋白在受精、成熟和疟原虫在蚊子体内的定殖中起重要作用。寄生虫表面蛋白分为两组：受精前和受精后蛋白，它们构成了疟疾TBV开发的基础。Pfs48/45和Pfs230是研究最广泛的恶性疟原虫受精前抗原，在配子体和配子上均有表达。Pfs230蛋白在雄性和雌性配子体中均有表达，并在配子表面以与Pfs48/45的复合物形式出现。Pfs48/45对雄性和雌性配子融合形成合子至关重要。一部分配子体在人类宿主中死亡而未传递给蚊子，从而使配子体表面抗原暴露于人类免疫系统。自然获得的抗配子体免疫力在反复暴露于配子体后产生。基于针对覆盖Pfs230的多个片段产生的抗体，Pfs230结构域1（Pfs230D1M）已被确认为抗体靶向的最稳健区域。功能性Pfs48/45抗体与Pfs48/45蛋白的所有三个结构域结合，其中最强的功能活性靶向结构域1和3中的表位。最先进的恶性疟原虫受精后抗原Pfs25在合子和动合子上表达，仅在蚊子媒介中，但转录可能发生在循环配子体中。尽管Pfs25不是人类自然获得性免疫的靶标，但疫苗诱导的抗体已被证明抑制卵囊发育，这为开发Pfs25作为TBV提供了基础。传播阻断抗体已被证明可中断蚊子中肠内配子的受精和寄生虫可传播形式的发育。

自然获得的抗Pfs230和Pfs48/45蛋白抗体已被证明在标准膜饲喂实验（SMFA）中将蚊子感染率显著降低90%以上。然而，关于这些抗体在不同疟疾流行地区的流行率和变异以及它们如何与影响传播的因素（包括年龄、寄生虫血症和传播强度等）相关的知识有限。评估自然诱导的抗配子体对寄生虫靶蛋白的反应对于推动传播阻断疫苗的开发至关重要，特别是在疟疾流行地区。本研究确定了针对恶性疟原虫传播阻断靶抗原Pfs230D1M和全长Pfs48/45的自然获得性抗体的血清阳性率、水平和潜在功能，作为在坦桑尼亚Bagamoyo进行传播阻断疫苗候选Pfs25-IMX313/Matrix-M的1期临床评估的基线。

方法

研究区域

研究在坦桑尼亚沿海地区的Bagamoyo区进行。该地区代表异质性疟疾传播，一般人群中的疟疾患病率估计在7%至39%之间。根据美国总统疟疾倡议（PMI）指南，对Bagamoye区的五个具有不同疟疾传播强度的地点进行了调查：Bagamoyo镇、Fukayosi和Yombo为低至中度传播（5%至30%的疟疾感染患病率），Wami-Mkoko和Miono为高强度传播（>30%的疟疾感染患病率）。疟疾传播强度在长雨季期间和之后通常很高，长雨季通常发生在3月至6月。大多数报告病例由恶性疟原虫引起，但也有其他疟原虫物种的报告。研究区域报告的媒介控制实践是使用覆盖率为69%的蚊帐（每两人有一个蚊帐的家庭）和房屋改造，其中65%的家庭有纱窗，13%有封闭的屋檐。研究区域未进行大规模药物管理。

研究设计和人群

在2022年5月至8月期间进行了一项血清调查。共有290名5-45岁、无疟疾临床症状的参与者通过简单随机抽样从小学、外围诊疗所和社区疟疾检测营中招募。在村卫生队进行大规模宣传后，邀请参与者进行抗体和疟疾检测。在290名招募的参与者中，全部检测了Pfs48/45 IgG，281名检测了Pfs230D1M和Pfs48/45 IgG，117名检测了所有三种抗原（Pfs48/45、Pfs230D1M、Pfs25）。在57名参与者中评估了抗体持久性，从2022年7月到2023年3月进行了五次采样，基线采样在2022年6月。通过标准膜饲喂实验在10名参与者中评估了抗体功能。

血液样本采集和保存

将血液样本采集到含有乙二胺四乙酸（EDTA）的2.0 mL管中。立即将200 μL保存在600 μL的1× DNA/RNA Shield?（Zymo Research, Irvine, USA）中，用于核酸提取，以使用定量聚合酶链反应（qPCR）检测每位参与者中的循环疟疾寄生虫。使用300 μL收集的血浆检测针对Pfs230D1M、Pfs48/45和Pfs25抗原的总IgG抗体。保留2 mL血液样本的剩余部分用于通过标准膜饲喂实验确定抗体功能。

重组蛋白

全长Pfs48/45和Pfs25的生产如前所述。Pfs230的截短重组版本称为Pfs230D1M，基于全长3D7序列（GenBank?登录号XP_001349600.1），包含残基Ser⁵⁴²至Gly⁷³⁶，并在位置585有一个Asn到Gln的突变以去除N-糖基化位点。Pfs230D1M在实验室中使用pPIC9K载体（Invitrogen, California, USA）在毕赤酵母（Invitrogen）中作为分泌蛋白表达。所有蛋白均包含C末端EPEA基序，以允许使用C标签亲和色谱（Thermo Fisher Scientific, UK）进行初始捕获，随后通过HiLoad 16/600 Superdex 200 PG柱（Cytiva, Uppsala, Sweden）进行凝胶过滤抛光步骤。

标准化酶联免疫吸附测定

对血浆样本进行酶联免疫吸附测定（ELISA），以检测和测量针对重组Pfs48/45、Pfs230D1M和Pfs25抗原的总IgG水平，遵循先前描述的方案。简而言之，ELISA板孔 overnight 包被50 μL浓度为2 μg/mL的Pfs48/45、Pfs230D1M或Pfs25重组蛋白。用StartingBlock? T20（PBS）封闭缓冲液（Thermo Fisher Scientific, UK）封闭1小时，然后将50 μL稀释的测试血浆样本以三重复孔加入ELISA微孔板中。将板在室温下孵育2小时，然后加入检测抗体[碱性磷酸酶偶联的山羊抗人IgG（γ链）]。将板在室温下孵育1小时，并加入100 μL pNPP与二乙醇胺底物以产生荧光。使底物显色25分钟，并使用BioTek微孔板阅读器（ELx808）和Gen5软件（v3.04）读取405 nm处的吸光度。在每个孵育步骤之间，用1× PBS + 0.05% Tween 20洗涤板六次。使用标准曲线和来自参考样本的内部阳性对照进行ELISA。使用来自De Graaf等人的已知抗Pfs25血清作为Pfs25 ELISA的参考阳性对照。分别从20名供体（每种10名供体）制备Pfs230D1M和Pfs48/45参考血浆，如前所述。简而言之，将Pfs230D1M或Pfs48/45反应性血浆汇集并在StartingBlock? T20（PBS）封闭缓冲液中以1:800稀释度进行优化。对于每块板，总共六个孔与来自未暴露的英国（UK）供体的阳性对照和阴性对照血清一起孵育。使用不含测试血清的孔从每个样本中扣除背景反应性。将血清阳性 cutoff 点设置为高于英国供体 panel 平均值 + 2SD 的OD值。使用标准曲线和Gen5 ELISA软件v3.04（BioTek, UK）将单个测试样本的OD405转换为任意单位（AU）。

通过ELISA确定抗体亲和力

在评估抗体功能之前，进行了基于硫氰酸钠（NaSCN，一种离液剂）的亲和力测定，以估计抗体反应的亲和力，根据先前描述的方案。简而言之，根据标准化ELISA读数稀释每份血浆，以达到1的光密度（OD）。将血浆加入 overnight 包被有50 μL/孔2 μg/mL Pfs230D1M或Pfs48/45蛋白的ELISA板孔中。沿板向下增加浓度添加浓度范围为0至7 M的NaSCN离液剂。将板在室温下孵育15分钟，并加入检测二级抗体，随后加入pNPP与二乙醇胺底物（100 μL/孔）。使板显色后，在BioTek ELx808微孔板阅读器上用Gen5软件读取405 nm OD。亲和力指数（mol/L）确定为给出与无NaSCN相比50% OD值的NaSCN浓度。与抗原结合亲和力较低的抗体在比亲和力较高的抗体更低的NaSCN浓度下被破坏。

Pfs230D1M和/或Pfs48/45阳性IgG的离体功能

使用恶性疟原虫NF54实验室株配子体评估Pfs230D1M和Pfs48/45抗体的功能活性。根据先前发布的方案维持配子体培养。简而言之，以0.15%–0.2%的无性寄生虫血症和5%的血细胞比容在10 mL完全培养基（RPMI-1640，含6 g/L HEPES、50 mg/L次黄嘌呤、2.5 g/L碳酸氢钠和10%人血清）中启动培养物。在受控气体条件（90%氮气、5%二氧化碳、5%氧气）下维持培养16天，每天更换培养基。维持至少三个相同的重复培养物。对于每个实验，基于V期配子体血症和出丝水平汇集至少两个重复。将培养基更换为正常人血清、正常红细胞（RBCs），V期配子体血症约为0.15%，血细胞比容为50%（1 mL血清：1 mL RBCs）。雄性与雌性配子体比率稳定在1:2–3。使用的人血清和RBCs购自Interstate Blood Bank, Inc., USA。

使用标准膜饲喂实验（SMFA）评估对Pfs230D1M和/或Pfs48/45抗体呈阳性的总IgG减少恶性疟原虫在蚊子中感染的能力，如Miura等人先前所述。

使用Protein G亲和色谱纯化来自单个样本的总IgG，并在PBS中重构至最终浓度40 mg/mL。然后将纯化的人IgG（10 mg/mL）在30°C下与NF54恶性疟原虫配子体混合，并立即通过Parafilm^?膜喂给4–6天龄实验室饲养的斯氏按蚊蚊子。浓度为93.8 μg/mL的小鼠单克隆抗体4B7用作阳性对照。阴性对照是来自汇集疟疾 naive 人血清的纯化IgG（10 mg/mL）（SMFA-1）或来自汇集正常小鼠血清的纯化IgG（0.75 mg/mL）（SMFA-2）。喂食后8天解剖蚊子中肠，并通过显微镜检查以评估测试和对照实验中的卵囊强度。每轮SMFA为每位志愿者解剖20只血餐蚊子。传播减少活性（TRA），即卵囊强度降低的百分比（%），相对于同一实验中测试的相应对照IgG计算。TRA计算如下：100 × {1 ?（测试IgG中的平均卵囊数）/（对照IgG中的平均卵囊数）}。阴性对照IgG的平均卵囊和%感染性在SMFA-1中为每只蚊子34个卵囊和100%感染性，在SMFA-2中为19个卵囊和98%。

通过RT-qPCR检测总寄生虫和配子体

通过qPCR测定保存在DNA/RNA Shield?中的血液样本中的总寄生虫血症，使用CFX96实时qPCR热循环仪，如Mulamba等人所述。使用Quick-DNA Miniprep Plus Kit（Zymo Research, USA）从疟原虫阳性血液样本中提取基因组DNA，并在50 μL洗脱缓冲液中洗脱。进行靶向泛疟原虫18S rRNA和恶性疟原虫特异性varATS序列的qPCR。这种方法提高了检测恶性疟原虫和非恶性疟原虫物种的特异性和敏感性。

为了确定配子体血症，使用了两种独立的疟原虫靶标的组合——雌性配子体特异性标记（CCp4）和雄性配子体特异性标记（PfMGET），来自Meerstein?Kessel等人。使用Quick-RNA? MiniPrep Plus kit（Zymo Research）从所有qPCR阳性样本中提取核糖核酸（RNA）。根据制造商的说明调整方案，如前所述。使用先前由Meerstein?Kessel等人描述的多重qRT-PCR检测检测恶性疟原虫配子体，如Mulamba等人所述。

统计分析

数据记录在Excel（Microsoft, 2016）中，并使用Stata版本16和GraphPad Prism版本10（GraphPad Software Inc., California, USA）进行分析。对参与者的人口统计学特征以及与配子体和抗体存在相关的状态（阴性或阳性）进行描述性分析，使用比例及其各自的95%置信区间（CI）。使用几何平均值（95%置信区间）描述性分析抗体反应，并在表格中呈现。使用Pearson相关系数（PCC）评估寄生虫密度对数与抗体滴度对数之间的相关性，以及Pfs230D1M和Pfs48/45抗体滴度之间的相关性。使用二元逻辑回归估计抗体滴度与以下因素之间的关联：年龄组（5–12岁、13–17岁和18–45岁）、性别（男性和女性）以及参与者地点（低和高传播）。还在多变量模型中执行似然比检验以评估每个变量的影响。对于SMFA结果，使用了零膨胀负二项模型。还采用二元逻辑回归评估寄生虫阳性与抗体血清阳性之间的关联，并针对年龄组、性别和参与者地点的人口统计学特征调整固定效应。此外，使用混合效应伽马回归探讨了Pfs230D1M和Pfs48/45抗体随时间的变化，给定数据的非正态分布，并为未调整模型调整了唯一标识的随机效应。调整后的模型包括年龄组、性别和参与者地点作为固定效应。

结果

研究参与者

在招募的290名参与者中，114名（39%）为儿童（5–12岁），44名（15%）为青少年（13–17岁），132名（46%）为成人（18–45岁）。每个年龄组的平均年龄（岁）分别为9岁、15岁和31岁，对应儿童、青少年和成人。女性参与者比例为51%。招募在低传播地点[124名（43%）]和高传播地点[166名（57%）]之间有所不同。

抗Pfs230D1M和抗Pfs48/45抗体的流行率

总体而言，56%（157/281）和49%（141/290）的参与者被分类为抗Pfs230D1M和抗Pfs48/45 IgG血清阳性。大约30%（86/281）的参与者对Pfs230D1M和抗Pfs48/45 IgG均呈血清阳性。在测试的117名参与者中未检测到抗Pfs25 IgG。抗Pfs230D1M和抗Pfs48/45 IgG的血清阳性率随参与者年龄显著增加，成人比儿童更可能具有抗体——Pfs230D1M[调整后OR 3.18（95% CI：1.85–5.57），p ≤ 0.0001]和Pfs45/48[OR 3.18（95% CI：1.83–5.29），p ≤ 0.0001]——反映了感染的累积暴露。抗Pfs48/45和抗Pfs230D1M IgG滴度之间存在显著正相关（R值：0.3021，p = 0.00001）。

抗体血清阳性与寄生虫阳性的关系

总寄生虫和配子体阳性率分别为23.5%和5.6%，并已在别处发表。Pfs48/45与寄生虫阳性之间存在显著关联。

抗体水平与寄生虫密度的相关性

抗体滴度与总寄生虫密度之间没有相关性，如图中所示：Pfs230D1M抗体滴度与寄生虫密度（R值：0.1172，p值 = 0.3235）和抗Pfs48/45滴度与寄生虫密度（R值：0.0451；p值 = 0.7046）。

Pfs230D1M和Pfs48/45抗体随时间的持久性

为了评估抗Pfs230D1M和抗Pfs48/45随时间推移的持久性，从高和低传播地区方便地选择了一组33名成人和24名儿童，在基线（2022年6月）采样之外，在跨越10个月的五个不同时间点进行了采样。在纳入纵向分析的57名参与者中，39名来自高传播地区，18名来自低传播地区。我们未能在10个月期间对青少年进行采样。基线时血清阳性的参与者在每个后续时间点保持血清阳性，其几何平均抗体反应如图所示。Pfs230D1M抗体反应随时间没有显著差异，而显示Pfs48/45抗体滴度在2022年8月至2023年3月之间显著下降。基线时血清阴性的参与者在所有时间点保持血清阴性，未纳入分析。

一小部分对Pfs230D1M和Pfs48/45抗体呈阳性的参与者显示出显著的TRA

通过ELISA对10名对Pfs230D1M和/或Pfs48/45抗原呈反应性的参与者的基线血浆样本中纯化的IgG通过单次SMFA单独测试了TRA。选择的10名参与者来自高传播地区，包括两名儿童和八名成人，他们收集了足够的血浆样本。10名参与者的个体抗体反应和亲和力指数如图所示。三名参与者（N006、N008和N019）对Pfs230D1M和Pfs48/45抗原均呈反应性。两名参与者（N001和N021）仅对Pfs48/45抗原呈反应性。五名参与者（N026、N055、N027、N028和N036）仅对Pfs230D1M抗原呈反应性。仅两名参与者（N006、N008），他们是成人，表现出显著的TRA。对N006和N008进行的独立SMFA证实了它们的显著抑制活性。

讨论

本研究首次确定了Bagamoyo中自然获得的针对Pfs230D1M和Pfs48/45传播阻断寄生虫蛋白的抗体的流行率。这些观察结果需要在规划疫苗试验时加以考虑，这些试验必须考虑预先存在的免疫力以及自然抗原暴露后潜在的免疫增强。我们发现了自然获得的针对恶性疟原虫配子体抗原——Pfs230D1M和Pfs48/45——的抗体反应的强有力证据，如前所述。所有测试抗Pfs25特异性IgG的参与者均为血清阴性，最可能是因为Pfs25转录本被认为仅在蚊子血餐后在中肠中翻译。

成人中Pfs230D1M和Pfs48/45抗体血清阳性率高于儿童，最可能是由于多年来反复暴露于配子体，如前所述。在儿童、青少年和成人中检测到的抗Pfs48/45和抗Pfs230D1M滴度没有显著差异，但低和高传播地区之间的血清阳性率存在显著差异。这表明近期寄生虫暴露在Pfs48/45特异性免疫存在中具有潜在作用。

很大一部分参与者在采样时没有配子体或寄生虫感染的情况下表现出抗Pfs230D1M或抗Pfs48/45 IgG阳性反应。检测到的抗配子体反应最可能是由于采样前先前配子体暴露的免疫反应所致。这一观察表明抗体可能作为配子体暴露的标志物，而不是活动性配子体血症的生物标志物。然而，30%–40%的成人对Pfs230D1M或Pfs48/45抗原ELISA阴性，但他们很可能曾多次感染。并发配子体可能反映抗配子体反应的发展，但可能并不总是观察到直接关联。采样前诱导的抗配子体抗体可能在配子体清除后持续数周。另一方面，在采样时对循环配子体的抗体诱导/增强可能需要更长时间，例如，在它们死亡/破坏和随后清除之后。

测量抗配子体反应的10个月期间恰逢长雨季结束和下一个雨季开始。这一时期的数据表明，抗Pfs230D1M和抗Pfs48/45 IgG反应是稳定的，尽管本研究未回答稳定的IgG反应是由于抗体反应的长寿命、重复配子体暴露还是两者兼而有之。应进行更详细的纵向研究，具有更大的样本量和年龄范围，以牢固确定抗配子体疟疾免疫的年龄依赖性，并提供关于这些反应持久性的更多证据。

对Pfs230或Pfs48/45抗原呈反应性的个体对卵囊强度缺乏显著抑制，表明抗体可能结合非阻断表位，或抗体水平不足以影响蚊子中的卵囊减少。在两个对Pfs48/45和Pfs230D1M抗原均呈反应性的样本中观察到高传播减少活性，与先前现场研究的报告相似，观察到的TRA可能归因于针对两种不同抗原的抗体的叠加或协同效应。然而，也有可能这两个个体对一种未知的传播阻断抗原呈反应性，需要进一步调查以充分理解促进这两名参与者中观察到的TRA的免疫反应。

本研究遇到了几个局限性；参与者仅从五个易于到达的地点招募，这可能限制了研究区域和样本量。此外，我们无法进行抗体耗竭测定以确定在两名参与者中观察到的TRA是否由Pfs48/45或Pfs230D1M IgG促进。尽管存在这些局限性，本研究中自然获得的抗Pfs48/45和Pfs230D1M抗体的流行率为针对这些抗原的疫苗诱导免疫的潜力带来了好消息，如其他研究所表明。最近在布基纳法索进行的Pfs48/45和Pfs230疫苗候选的1期试验发现，疫苗特异性反应增强了对各自抗原的预先存在的免疫力，这与先前的发现形成对比，即暴露于恶性疟原虫可能会减弱随后疫苗接种的增强。这些经验表明，在疟疾流行地区评估传播阻断疫苗需要考虑对性阶段疫苗抗原的自然获得性免疫反应。对Pfs48/45和Pfs230D1M蛋白的自然获得性抗体反应非常普遍且似乎稳定，表明半免疫人群可能是评估传播阻断疫苗候选增强传播阻断免疫的理想群体。