布普诺啡与大麻二酚联用在小鼠骨科创伤模型中显著降低生存率：药物相互作用与安全性警示

本研究通过小鼠胫骨骨折模型，发现布普诺啡（Buprenorphine）与大麻二酚（CBD）联合给药显著降低生存率（p < 0.05），而单药或载体对照组无差异。尸检提示死亡多源于胃肠动力障碍（GI complications）及呼吸抑制（OIRD）。研究强调在骨科创伤模型中需谨慎联用阿片类与 cannabinoids，并需进一步评估其药代动力学（CYP3A4、UGT2B7）及毒理机制。

　　

1 Introduction

骨科创伤是全球急诊入院最常见原因之一，尤其以下肢损伤为主。这类创伤会引发炎症级联反应，虽有利于组织修复，但过度或持续的炎症可能导致严重并发症。目前，骨科创伤后的镇痛策略仍是一个活跃的研究领域。非甾体抗炎药（NSAIDs）通过抑制环氧化酶（COX）缓解疼痛，但可能通过阻断前列腺素介导的骨形成与吸收而影响骨折愈合。卡洛芬（Carprofen）作为一种选择性COX-2抑制剂，在动物研究中广泛应用，但长期使用也会抑制骨形成。

布普诺啡是一种部分μ-阿片受体（MOR）激动剂，对δ-和κ-阿片受体具有拮抗作用，因其强效和长效的镇痛效果而被广泛用于实验动物研究。此外，它也是治疗阿片使用障碍（OUD）的核心药物，其部分激动活性在提供有效镇痛的同时降低了过量风险。然而，布普诺啡对胃肠道（GI）动力的抑制效应可能在其用于骨科创伤模型时带来并发症。此外，阿片类药物还与骨重塑的负面影响相关，包括降低骨矿物质密度。

大麻二酚（CBD）是大麻（Cannabis sativa）中的非精神活性成分，因其抗炎、神经保护和镇痛潜力而受到关注。尽管不直接激活MOR，CBD可通过间接调节阿片通路发挥作用。临床前研究表明，它通过抑制脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）增加内源性大麻素神经递质anandamide的水平，并通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）在神经性疼痛中发挥镇痛作用。CBD还能通过减少多巴胺摄取、抑制促炎细胞因子释放和减轻神经毒性来降低轻度创伤性脑损伤（mTBI）中的小胶质细胞激活。此外，CBD通过调节谷氨酸释放（大脑的主要兴奋性神经递质）发挥抗氧化作用。越来越多的证据突显了CBD的治疗潜力，包括在mTBI后改善认知功能和行为结果，以及减少癫痫发作频率。值得注意的是，最近一项使用小鼠胫骨骨折模型的研究表明，低剂量CBD既能缓解疼痛又能增强骨形成。重要的是，CBD具有良好的安全性，在临床前和临床研究中均鲜有严重不良反应的报道。然而， preclinical 数据也表明，CBD可能引起剂量依赖性不良反应，如肝毒性、线粒体功能障碍和氧化应激，尤其是在非常高剂量（例如，在啮齿类动物中>200 mg/kg）时。这些发现表明存在一个安全阈值，超过该阈值毒性风险增加。相比之下，临床试验一致表明，CBD在人类中在5至20 mg/kg/天的治疗剂量范围内耐受性良好，仅有有限的严重不良事件报告。这些观察结果支持了继续对CBD进行转化研究的重要性，前提是仔细选择给药方案并根据物种特异性药代动力学差异进行调整。

最近的研究表明，联合使用阿片类药物和大麻素可能提供协同镇痛作用，但不良相互作用的潜力仍然特征不足，特别是在复杂损伤模型中。

在这篇简要研究报告中，研究了四种镇痛方案——单独使用卡洛芬，或与布普诺啡、CBD或两者联合使用——对小鼠胫骨骨折骨科创伤模型生存的影响。评估了死亡率和尸检结果，以表征潜在的累积毒性和药物相互作用效应。这些发现可能有助于为临床前胫骨骨折模型中的镇痛选择提供最佳实践信息，并强调在转化研究中进行严格安全性评估的重要性。

2 Methods

2.1 Ethical approval, animal housing, and husbandry

所有程序均经H?pital du Sacré-C?ur当地动物护理委员会批准，并按照加拿大动物护理委员会的指导方针进行。八十只雄性C57BL/6小鼠（60-70天龄；Charles River Laboratories, Saint-Constant, QC, Canada）被单独饲养在温度控制（22°C–24°C）和湿度控制（30%–40%）的环境中，具有12小时光/暗周期。小鼠可自由获取标准啮齿动物饲料（Charles River, Rodent Chow 5075）和水，并在创伤诱导前至少适应1周。

2.2 Experimental groups and treatments

本研究中使用的所有CBD均为Sundial CBD Isolate，从Société québécoise du cannabis获得。多个批次由Université de Sherbrooke的Institut de pharmacologie的Plateforme de Bioanalyse独立分析纯度和浓度以确保一致性。通过二极管阵列检测液相色谱法确认所有批次的CBD纯度均超过97.64%。详细分析报告见补充材料S1, S2。小鼠被随机分配到四个治疗组之一（每组n = 20）：(1) CBD + 布普诺啡，腹腔注射（i.p.）CBD（100 mg/kg，每日一次，持续7天）加皮下注射（s.c.）布普诺啡（0.1 mg/kg，每12小时一次，持续3天），(2) 仅CBD，i.p. CBD（100 mg/kg，每日一次，持续7天），无阿片类药物，(3) 布普诺啡 + 载体，与上述相同的布普诺啡方案，加每日i.p.注射载体（1:1:18 乙醇:玉米油:生理盐水），以及(4) 仅载体，i.p. 载体每日一次，持续7天。所有动物均接受s.c.卡洛芬（20 mg/kg，每日一次，持续3天）作为标准术后镇痛。

2.3 Tibial fracture and stabilization

在骨折诱导前，于计划手术部位局部注射布比卡因-利多卡因混合物（总剂量：1.5 mg/kg）。将小鼠仰卧位固定，通过轻轻分离邻近肌肉暴露右膝关节。使用25G针头穿刺胫骨平台，并将0.45 mm不锈钢昆虫针插入髓腔作为髓内稳定器。然后使用11号手术刀片在胫骨干上制造一个缺口，并使用手术剪刀完成骨折。

2.4 Health monitoring and endpoints

使用标准化标准评估伤后8小时的恢复情况。每日临床评估跟踪体重、姿势、被毛状况、呼吸、伤口完整性和筑巢行为（补充表S1）。预定义的人道终点包括体重减轻≥20%、持续性共济失调或总死亡率超过20%。值得注意的是，由于骨折不稳定，载体治疗组中的一只小鼠不得不被排除。所有存活动物在第8天通过心内放血在氯胺酮（120 mg/kg）、甲苯噻嗪（10 mg/kg）和异氟烷麻醉下实施安乐死。

2.5 Statistical analysis

使用Kaplan-Meier生存曲线分析生存数据。使用GraphPad Prism（版本10.2.3）中的Mantel-Cox（log-rank）检验进行组间 pairwise 比较，以评估不同镇痛方案的死亡率差异。p值<0.05被认为具有统计学显著性。

3 Results

3.1 Survival outcomes

在骨科创伤诱导后，每天监测生存情况7天。前8小时连续观察小鼠，然后在第一个24小时内每6小时观察一次，随后每天三次直到研究终点。第7天生存率分别为：CBD + 布普诺啡组65%，仅CBD组95%，载体 + 布普诺啡组95%，仅载体组100%。Pairwise比较显示，CBD + 布普诺啡组与其它各组之间存在统计学显著差异（p < 0.05），而其它组间比较未观察到差异。所有 pairwise 比较的全面风险比（HR）和置信区间（CI）见表1。

3.2 Necropsy findings and causes of death

在总共9例死亡中，7例（78%）归因于胃并发症。按治疗组分层时，GI并发症发生在CBD + 布普诺啡组的6/20只小鼠和布普诺啡单独组的1/20只小鼠中。在仅CBD组（0/20）或仅载体组（0/19）中未观察到GI并发症。发现五只动物死亡，没有任何痛苦的前兆。其余两只，均在CBD + 布普诺啡组，表现出严重的健康状况恶化并被实施安乐死。尸检显示明显的胃胀气、变色的胃内容物、以及空或扩张的肠道并伴有积气和积液。这些发现与GI动力受损一致，这是MOR激活的已知效应，并可能因CBD对肠道功能的影响而加剧。在CBD + 布普诺啡组（1/20只小鼠）和仅CBD组（1/20只小鼠）中观察到呼吸系统并发症。两只动物均在CBD给药后10分钟内出现突然虚脱、姿势丧失和呼吸费力，并迅速进展为呼吸衰竭。尸检未发现气管阻塞、肺水肿或出血迹象，排除了机械性损伤或误吸作为原因。

4 Discussion

目前的发现表明，虽然在卡洛芬存在的情况下，布普诺啡和CBD在小鼠骨科创伤模型中单独使用时耐受性良好，但它们的共同给药会降低生存率。这种死亡率模式强调了在临床前模型和转化研究中调查药物-药物相互作用的重要性，特别是阿片类-大麻素组合。

4.1 Pharmacodynamic and pharmacokinetic considerations

动物研究中的镇痛剂选择必须谨慎，以尽量减少与其他实验化合物的潜在药物-药物相互作用。布普诺啡是实验室研究中的标准镇痛剂，是MOR的部分激动剂和δ-和κ-阿片受体的拮抗剂。MOR激活介导其主要的镇痛作用，而CBD间接调节内源性大麻素系统，包括通过变构调节和抑制FAAH。因此，共同给予布普诺啡和CBD可能由于重叠或相互作用的药效学途径而增加不良反应的风险。此外，据报道CBD调节免疫和炎症信号通路，包括小胶质细胞激活和细胞因子释放，这可能改变对创伤的全身反应并导致不良后果。

布普诺啡的部分激动剂性质导致其镇痛效力可变，并且对呼吸抑制具有已知的天花板效应。这在多创伤模型中尤其相关，因为并发损伤会增加生理应激和代谢需求，当联合使用多种镇痛药时可能恶化不良后果。此外，布普诺啡和CBD共享代谢途径，包括通过UDP-葡萄糖醛酸转移酶-2B7（UGT2B7）进行葡萄糖醛酸化，并且新出现的临床数据表明，大麻使用可能通过抑制细胞色素P450 3A4（CYP3A4）而提高布普诺啡及其代谢物的血浆浓度。

镇痛给药方案的选择必须基于转化相关性以及在疗效和副作用之间的适当平衡。在本研究中，布普诺啡（0.1 mg/kg）皮下注射，每12小时一次，持续72小时，而CBD（100 mg/kg）腹腔注射，每日一次，持续7天。选择100 mg/kg腹腔注射的CBD剂量是基于先前证明在该范围内具有镇痛、抗炎和神经保护作用的临床前研究。使用美国食品药品监督管理局（FDA）推荐的Km因子，该剂量对应于大约8.1 mg/kg的人体等效剂量，这落在临床研究中报告的治疗范围（5-20 mg/kg）内。该剂量还考虑了与人类相比，啮齿类动物更高的代谢率和更短的CBD半衰期。虽然这一理由支持了我们给药策略的转化相关性，但缺乏剂量反应分析仍然是一个限制，并限制了研究结果的普遍性。

尽管一些研究建议每4-8小时给予一次布普诺啡，但其他研究已证明更长的间隔6-12小时也能有效镇痛。选择的布普诺啡方案（0.1 mg/kg 皮下注射，每12小时一次）代表了确保充分镇痛和最小化操作（这可能有助于骨折模型中的骨畸形愈合）之间的平衡。选择12小时的给药间隔是一种务实的方法，与先前的骨折研究一致。尽管如此，它可能影响了系统暴露和潜在的药物-药物相互作用。

给药途径也影响药物暴露和相互作用潜力。在本研究中，CBD通过腹腔注射给药，布普诺啡通过皮下注射给药，它们在吸收动力学和生物利用度上有所不同。需要进一步研究以确定这些差异如何影响药物暴露和药效学相互作用。

此外，长期给予CBD可能导致累积毒性，特别是在布普诺啡存在的情况下。未来的研究应包括药代动力学分析、肝酶测量（例如，丙氨酸氨基转移酶ALT、天冬氨酸氨基转移酶AST）、氧化应激指标和系统细胞因子分析，以阐明重复CBD暴露的生理负担。

重要的是，尽管CBD是一种大麻素，但其作用机制与经典大麻素受体1（CB1）受体激动剂明显不同。与直接激活CB1受体以发挥中枢镇痛作用的化合物（如Δ⁹-四氢大麻酚或WIN 55,212-2）不同，CBD通过抑制FAAH、增加内源性anandamide水平以及调节其他受体如瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1（TRPV1）、5-羟色胺1A（5-HT1A）受体和PPARγ间接起作用。这些机制差异可能解释了安全性特征和药理学相互作用的变化。未来的研究应比较CBD与选择性CB1激动剂，以评估本研究中观察到的不良反应是CBD独特药理学特有的，还是可推广至大麻素-阿片类药物组合。

总之，优化临床前骨科创伤模型中的生存和转化价值需要严格理解布普诺啡和CBD等药物之间的药效学和药代动力学相互作用。镇痛选择必须基于机制洞察、给药途径、给药策略和累积暴露来告知，以在保持疗效的同时最小化风险。

4.2 Survival outcomes and mortality patterns

虽然布普诺啡单独组、CBD单独组和载体单独组之间的生存率相当，但当两种药物共同给药时，生存率显著下降。在所有动物中，布普诺啡单独组（1/20）和CBD单独组（1/20）的死亡率仍然较低，但在CBD + 布普诺啡组中增加到7/20。在仅载体组中没有发生死亡，该组动物仅接受卡洛芬作为标准术后镇痛。观察到CBD + 布普诺啡组与其它各组之间存在显著差异（p < 0.05）。

虽然本研究未评估治疗的镇痛效果，但它侧重于识别联合使用不同治疗剂时可能导致死亡的不良反应。尸检结果确定了两个主要死亡原因：GI不良反应（9例中的7例）和注射后急性呼吸窘迫（9例中的2例）。已知布普诺啡会降低GI动力，尽管程度低于全MOR激动剂如吗啡，并且是公认的阿片诱导便秘的促成因素。CBD也与肠道动力改变、肠道分泌调节和微生物群失调相关，可能通过激活TRPV1和5-HT1A受体途径。尽管NSAID通常与GI并发症相关，但像卡洛芬这样的选择性COX-2抑制剂与非选择性COX抑制剂相比风险显著降低。因此，在CBD + 布普诺啡组中观察到的高GI并发症发生率可能反映了对肠道功能的累积不良反应，而不是单纯的直接药代动力学相互作用。联合治疗组中的高死亡率表明对GI生理学具有叠加或协同效应，而不是孤立的毒性。

相比之下，归因于呼吸窘迫的两例死亡可能反映了阿片诱导的呼吸抑制（OIRD），这是MOR调节的已知不良反应。骨科创伤等条件可能破坏血脑屏障（BBB）完整性，潜在地增加中枢神经系统对阿片类药物的暴露并提高OIRD的风险。未来的研究应包括动脉血气分析和体积描记法以更精确地评估呼吸功能。此外，BBB紧密连接蛋白（例如，claudin-5、ZO-1、occludin）的组织病理学评估可以阐明屏障破坏是否与生存结果相关。

为了进一步表征潜在毒性，需要对肝脏和GI道进行组织学分析，以评估CBD-布普诺啡共同给药造成的器官特异性损伤。

尽管这些发现表明共同给予CBD和布普诺啡会增加死亡风险，但当在没有阿片类药物的情况下或根据替代给药策略给药时，CBD可能仍然在胫骨骨折模型中带来益处。未来的研究应改进给药方案，并评估镇痛效果和安全性，以优化临床前骨科创伤模型中的转化相关性。

4.3 Implications for analgesic selection in complex injury models

镇痛方案的选择对骨科创伤临床前模型的生存结果具有关键影响。虽然阿片类药物和CBD之间药效学关系的确切性质，无论是协同还是拮抗，仍有待完全阐明，但数据表明它们的组合可能构成更高的风险，应谨慎对待。未来的研究应旨在阐明可能影响系统药物暴露的潜在药代动力学相互作用，并优化在不妨碍镇痛效果的情况下最小化累积毒性的给药策略。

药代动力学分析仍然是阐明CBD和布普诺啡之间潜在药物-药物相互作用的重要途径。未来的研究应纳入CBD其主要代谢物（7-羟基大麻二酚和7-羧基大麻二酚）、布普诺啡和去甲布普诺啡在多个时间点的血浆浓度测量，以评估系统暴露和代谢清除率。这些数据将有助于确定CBD是否以有助于本模型中观察到的死亡率增加的方式改变布普诺啡的药代动力学。

同样重要的是整合标准化的伤害性感受结果测量，以确保以安全为重点的方案不会无意中减少疼痛控制。鉴于多创伤模型中重叠损伤相关的生理负担增加，仔细监测GI功能、呼吸参数和神经恢复至关重要。这些考虑对于推进更安全、更有效的多模式镇痛方案的发展至关重要，这些方案对复杂的临床场景具有增强的转化相关性。

4.4 Study limitations

普遍给予卡洛芬，虽然在伦理上是术后镇痛所必需的，但代表了一个重要的限制。虽然这也反映了临床实践，但卡洛芬已知会影响GI生理学，并且其与布普诺啡或CBD同时使用可能促成了观察到的GI并发症。这种潜在的混杂效应限制了将死亡率 exclusively 归因于CBD-布普诺啡相互作用的能力。因此，未来的研究应包括没有NSAID背景治疗的组，以更好地分离药物特异性效应。

本研究的一个额外限制是创伤性程序导致的神经病变可能促成了观察到的结果。尽管未直接评估这一因素，但不能排除其作为死亡率或并发症的促成因素。认识到这种可能性也突出了未来转化研究神经修复机制的一个途径。

另一个重要的限制是缺乏详细的组织病理学和生化分析。尽管大体尸检提示GI和呼吸系统并发症，但这些发现无法确定因果关系。因此，未来的研究应包括对GI、肝脏、肺和中枢神经系统组织的系统组织学评估，以及生化标志物，如肝酶活性、氧化应激指数和BBB完整性评估。系统炎症负担的测量也可能提供机制性见解。纳入这些方法对于定义与联合CBD-布普诺啡治疗观察到的死亡率增加相关的因果途径至关重要。

此外，缺乏经过验证的伤害性感受测量防止了直接比较治疗组间的镇痛效果。未来的研究应纳入已建立的疼痛测定法，例如von Frey测试或热退缩潜伏期，以更好地评估每种方案的风险-效益比。

关于统计结果，应注意，虽然HR表明组间存在显著差异，但几个比较伴随着宽的CI，反映了由于相对较小的样本量导致的估计不稳定性。这一限制降低了统计主张的稳健性，并强调了在更大队列中复制以验证观察到的死亡率模式的必要性。