MTHFR基因多态性与不孕女性维生素D状态的关联：同型半胱氨酸介导作用分析

本研究发现MTHFR C677T多态性与不孕女性维生素D缺乏风险显著相关，其中同型半胱氨酸（Hcy）介导了15.8%（CT基因型）和41.6%（TT基因型）的效应。研究通过大样本（n=6,344）回顾性分析和中介模型，揭示了叶酸代谢通路与维生素D状态的新型关联机制，为不孕症的个体化营养干预提供了重要理论依据。

　　

引言

甲基烯丙基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是叶酸代谢途径中的关键酶，负责调节叶酸代谢和同型半胱氨酸（Hcy）甲基化过程。C677T和A1298C是MTHFR基因最常见的两种多态性位点，这些位点的突变会降低MTHFR酶活性，导致5,10-亚甲基四氢叶酸向5-甲基四氢叶酸的转化受阻，以及半胱氨酸向蛋氨酸的代谢紊乱，从而引起叶酸和同型半胱氨酸代谢异常。MTHFR C677T突变使第677位的丙氨酸变为缬氨酸，导致酶活性显著下降，纯合TT基因型仅保留约30%的酶活性。而A1298C多态性虽然也会降低酶活性，但影响程度较轻。

叶酸缺乏或MTHFR基因缺陷在动物模型、细胞培养和人类研究中均表现出DNA低甲基化和异常生化表型。目前MTHFR基因检测已广泛应用于临床叶酸代谢能力评估，并为孕前或孕期补充叶酸等药物使用提供参考。大量研究表明MTHFR C677T和A1298C多态性与复发性流产（RPL）存在关联，同时还与多种妊娠相关并发症如子痫前期有关。然而MTHFR多态性与辅助生殖技术结局的关系仍存在争议。

MTHFR基因突变会导致同型半胱氨酸水平升高。Hcy作为蛋氨酸代谢的中间产物，其升高与促氧化和促血栓形成状态相关，可诱导内皮功能障碍，进而损伤多种器官和组织。尽管MTHFR多态性和/或高同型半胱氨酸血症与心血管风险和不良妊娠结局密切相关，但研究表明通过增加叶酸摄入来降低Hcy水平并不一定能有效减少不良结局风险，甚至可能产生相反效果，提示其他因素可能干扰叶酸代谢途径并影响其下游效应。

维生素D缺乏是全球女性面临的健康问题，与心血管疾病、癌症和全因死亡率相关，同时也与不良妊娠结局和女性生殖疾病有关。维生素D通过激活维生素D受体来调控靶基因转录，进而参与多种生物学过程。除众所周知的钙平衡和骨骼健康作用外，维生素D还调节细胞增殖分化、凋亡、血管生成、抗炎反应、免疫调节和多种代谢途径。

叶酸代谢与维生素D之间的关系尚不明确。既往研究表明叶酸可能影响骨骼健康，这可能与维生素D功能相关，且MTHFR多态性可能与骨密度存在关联。在维生素D缺乏小鼠中，联合补充叶酸、维生素B₁₂和维生素D比单独补充维生素D更能改善学习记忆能力。研究显示普通人群中25-羟基维生素D[25(OH)D]与Hcy水平呈负相关，且维生素D缺乏和高同型半胱氨酸血症都是心血管疾病的危险因素。曾有研究探讨MTHFR C677T多态性对RPL女性血清维生素D和Hcy水平的影响，但该研究样本量较小（n=837）且仅纳入RPL女性，结果可能无法推广到其他人群。

研究方法

研究设计与参与者

本研究为回顾性研究，纳入2019年1月至2024年5月期间在生殖中心接受全面不孕评估的患者，所有患者均进行了MTHFR基因多态性、血清Hcy和25(OH)D水平检测。纳入标准为已开始备孕叶酸补充的不孕患者，排除标准包括使用激素治疗、3个月内接受维生素D和钙剂治疗、子宫异常、肾脏疾病、高血压、糖尿病和肿瘤等基础疾病，以及核心数据缺失者。根据国际指南建议，将血清维生素D缺乏定义为<50 nmoL/L。

生化参数测量

在患者首次就诊时采集血样进行生化参数检测。血清25(OH)D、抗缪勒管激素（AMH）和空腹胰岛素采用化学发光法检测；血清Hcy、空腹血糖、甘油三酯和总胆固醇采用酶法测定；血清低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和血红蛋白采用比色法检测。

MTHFR基因多态性分析

使用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，采用荧光定量聚合酶链反应测定MTHFR C677T和A1298C位点的基因型。MTHFR C677C、C677T和T677T分别定义为野生型（CC）、杂合型（CT）和纯合型（TT）；MTHFR A1298A、A1298C和C1298C分别定义为野生型（AA）、杂合型（AC）和纯合型（CC）。

统计分析

采用SPSS 22.0和R软件进行统计分析。连续变量根据正态性检验结果以均值±标准差或中位数（四分位距）表示，组间比较采用t检验、Mann-Whitney U检验、方差分析或Kruskal-Wallis检验。分类变量以频数（百分比）表示，采用卡方检验或Fisher精确检验。使用logistic回归模型分析MTHFR多态性对维生素D缺乏的影响，多元线性回归模型分析对25(OH)D水平的影响。通过有向无环图（DAG）筛选协变量，建立两个调整模型：模型1调整年龄、BMI、AMH、不孕类型和不孕原因；模型2额外调整血红蛋白和采血季节。

采用平滑曲线拟合模型探讨血清25(OH)D水平或维生素D缺乏与血清Hcy水平的关系，使用广义线性模型和广义可加模型探索潜在关联，并通过最大似然法检验非线性。采用Spearman相关分析计算总人群和不同MTHFR C677T基因型人群中Hcy与25(OH)D的相关系数。

中介分析

采用Baron和Kenny提出的三步法中介绍分析框架，评估MTHFR多态性对维生素D状态的直接和间接效应（通过Hcy）。建立三个模型：1）MTHFR多态性对维生素D状态的总效应；2）MTHFR多态性对Hcy的效应；3）控制Hcy后MTHFR多态性对维生素D状态的直接效应。间接效应计算公式为β₃×β₅，中介比例计算公式因结局变量类型而异（连续变量或二分类变量）。采用Bootstrap法抽样1000次计算间接效应和中介比例的标准误和95%置信区间。

研究结果

患者特征与维生素D分层

共纳入6344例符合标准的不孕患者。按维生素D缺乏阈值分为两组后，除年龄、Hcy、MTHFR C677T基因型、血红蛋白和采血季节外，其他特征两组间具有可比性。25(OH)D≥50 nmoL/L组中年龄≥35岁者比例显著高于<50 nmoL/L组（31.4% vs. 27.4%）。MTHFR C677T基因型分布在两组间差异显著（p<0.001），而A1298C基因型分布无差异。维生素D缺乏组Hcy水平显著较高（中位数7.5 vs. 7.1 μmoL/L），血红蛋白水平较低（中位数132 vs. 133 g/L）。采血季节分布存在显著差异，提示冬季和春季维生素D缺乏患病率较高。

MTHFR基因多态性分布

MTHFR C677T的CC、CT和TT基因型患病率分别为53.8%、37.5%和8.7%，C和T等位基因频率分别为0.73和0.27。MTHFR A1298C的AA、AC和CC基因型患病率分别为59.2%、35.1%和5.8%，A和C等位基因频率分别为0.77和0.23。

基因型分组特征比较

按MTHFR C677T基因型分组比较发现，年龄、BMI、不孕类型、不孕持续时间、AMH、血红蛋白和代谢指标在三组间无差异。值得注意的是，677CT和TT基因型患者维生素D缺乏风险显著高于CC基因型（27.8%和29.7% vs. 23.9%）。不同C677T基因型间不孕原因和Hcy水平存在显著差异。而MTHFR A1298C基因型各组间所有参数包括维生素D状态和Hcy水平均无显著差异。

可视化分析显示，C677T多态性中，TT变异型Hcy水平显著高于CC和CT变异型，CT变异型Hcy水平显著高于CC变异型。25(OH)D水平在TT和CT变异型中显著低于CC变异型。A1298C多态性对Hcy和25(OH)D水平无影响。

MTHFR多态性与维生素D状态的关联

多因素logistic回归分析显示，在模型1调整后，MTHFR 677CT（调整后OR=1.225）和TT（调整后OR=1.355）与维生素D缺乏风险呈正相关。模型2调整后结果一致。MTHFR A1298C多态性在两个模型中均对维生素D缺乏无显著影响。

多元线性回归分析显示，在模型1中，MTHFR 677CT（B=-1.371）和TT（B=-2.799）与血清25(OH)D水平呈负相关。模型2中C677T基因型对25(OH)D水平的影响相似。A1298C基因型在两个模型中对25(OH)D水平均无显著影响。

按年龄分层分析发现，在<35岁亚组中，MTHFR 677CT（调整后OR=1.227）和TT（调整后OR=1.421）与维生素D缺乏风险正相关。而在≥35岁亚组中，C677T对维生素D缺乏的影响不显著。A1298C多态性在年轻亚组中AC基因型与维生素D缺乏负相关，在年长亚组中无关联。

MTHFR多态性、维生素D缺乏与Hcy的关联

平滑曲线拟合显示血清Hcy与25(OH)D水平呈线性负相关（p_非线性=0.063），与维生素D缺乏风险呈线性正相关（p_非线性=0.261）。Spearman相关分析显示总人群中Hcy与25(OH)D水平呈负相关（R=-0.137），TT基因型人群中负相关程度更高。

中介分析显示，CT vs. CC对维生素D缺乏的总效应显著（OR=1.23），控制Hcy后直接效应仍占主导（OR=1.20）。Hcy介导的间接效应显著（OR=1.03），中介比例为15.8%。TT vs. CC对维生素D缺乏的总效应更为显著（OR=1.36），但其直接效应无统计学意义（OR=1.21），而Hcy介导的间接效应显著（OR=1.12），中介比例达41.6%。以25(OH)D水平为结局的分析显示一致趋势，Hcy介导了CT vs. CC效应的20.4%和TT vs. CC效应的39.9%。

讨论

本研究首次在大样本不孕女性中证实MTHFR C677T多态性与维生素D状态显著相关，并量化了Hcy的中介作用。研究发现677CT和TT基因型患者维生素D缺乏风险和血清Hcy水平显著高于野生型，而A1298C多态性无显著影响。中介分析表明C677T对维生素D状态的影响通过直接和间接途径共同实现，其中TT基因型的效应主要由Hcy介导。

与既往研究相比，本研究结果与Ota等人在RPL人群中的发现一致，但该研究样本量小且人群局限。本研究通过大样本分析和精确统计模型，提供了更可靠的证据。MTHFR C677T多态性与Hcy水平的关联已在不同人群中得到证实，而A1298C的相关性较弱也与既往研究一致。维生素D缺乏与高同型半胱氨酸血症在动脉粥样硬化性疾病和不良妊娠结局中的共同作用已有报道，本研究进一步揭示了两者在基因层面的内在联系。

研究结果具有重要临床意义。鉴于叶酸和维生素D在女性生殖中的关键作用，MTHFR C677T变异筛查可能在不孕评估中具有价值。早期识别叶酸代谢异常个体可指导个性化干预，如活性叶酸和维生素D补充。Hcy可能作为可调节的中间靶点改善生殖结局。中介分析提示C677T对维生素D状态存在直接和间接效应，其中TT携带者通过Hcy的间接效应尤为突出。

叶酸代谢途径可能影响维生素D状态。既往研究表明皮肤中维生素D生物合成与叶酸代谢相关，家禽研究中叶酸补充显著提高蛋中维生素D水平。另一方面，维生素D可能影响叶酸代谢途径，体外细胞培养和超重生殖女性研究中发现维生素D可降低Hcy水平，提示其可能调节同型半胱氨酸代谢相关酶的基因表达。

某些研究中增加叶酸剂量对母儿无效甚至有害，维生素D补充在多项临床试验中未显示获益，其背后原因未知。维生素D调控途径与叶酸代谢相关途径存在诸多共同点，包括炎症、免疫调节和多种代谢过程。由此推测，单独补充叶酸可能无法完全改善叶酸代谢异常相关疾病，在C677T多态性人群中联合补充叶酸和维生素D可能更有益，二者可能协同影响叶酸代谢途径和下游功能。目前尚无人群中联合补充叶酸和维生素D的研究，未来值得探索。

研究局限性

研究的回顾性性质导致无法获取吸烟习惯、体力活动、叶酸补充剂量和持续时间等特征。虽然不孕女性已开始备孕叶酸补充，但剂量和时间差异可能引入无法控制的混杂，影响中介效应估计准确性。未来需要前瞻性研究标准化补充剂使用数据收集。此外，研究对象为不孕女性，结果可能不适用于普通人群或绝经女性。年龄差异可能影响结果解释，分层分析显示年轻亚组中C677T多态性与维生素D缺乏相关，而年长亚组中无关联，A1298C多态性也表现出年龄特异性效应。叶酸和/或维生素D补充在年轻人群中纠正MTHFR多态性潜在不良效应的效果可能更好。结果解读需谨慎，需要外部验证。

结论

MTHFR C677T多态性与不孕女性维生素D缺乏的联系可能通过直接和Hcy介导途径共同实现。推测MTHFR C677T多态性不孕患者中Hcy升高和维生素D缺乏可能共同导致叶酸代谢异常相关疾病的发生。需要进一步研究叶酸代谢与维生素D相互关系的机制，并 urgently 开展叶酸与维生素D联合补充的临床试验。