Grp78与HSP70同源序列作为肿瘤共享抗原通过链球菌超抗原机制激发抗肿瘤免疫反应的免疫信息学研究

本综述通过多步骤免疫信息学分析，首次揭示链球菌超抗原（SAg）与热休克蛋白（HSP70/Grp78）在免疫优势表位上的高度相似性，提出细菌感染可能通过分子模拟机制激活对肿瘤HSPs的交叉免疫反应，为肽段疫苗设计和肿瘤免疫治疗策略提供新视角。

　　

引言

细菌疗法作为新型肿瘤免疫治疗策略近年来备受关注。其中产超抗原（SAg）毒素的细菌因其能诱导强烈炎症反应破坏肿瘤细胞而被认为尤其有效。基于链球菌制剂抗肿瘤功效的证据以及热休克蛋白（HSPs）在肿瘤进展中的已知作用，本研究提出假说：链球菌SAgs可能通过与肿瘤相关HSPs高度相似的表位激活细胞毒性T细胞，从而引发针对肿瘤的适应性免疫反应。

方法

通过多步骤免疫信息学分析，采用疫苗表位设计的常用工具进行比较研究。首先对链球菌外毒素进行多序列和结构比对，重点分析SAg区域与HSPs的序列相似性。筛选与SAg区域相似度最高的HSP序列，预测其MHC-I、MHC-II和B细胞表位，仅保留具有阳性I类免疫原性值的表位与外毒素SAg区域表位进行比对。

蛋白质序列从UniProtKB/Swiss-Prot获取，包括化脓性链球菌（M18血清型）的四种外毒素：SPEA_STRP8、SPEC_STRP8、SPEM_STRPY和SPEK_STRPY。分析的人类HSPs包括：内质网蛋白（ENPL）、HSP90-α、内质网伴侣BiP（Grp78）、HSP70 kDa 1A（HS71A）和HSP60。使用T-Coffee和Clustal Omega进行多序列比对，Expresso功能评估结构相似性。BLAST验证HSPs与肿瘤标志物5T4和CEA之间的序列保守性。

MHC-I表位预测使用IEDB分析资源，采用NetMHCpan EL 4.1和Ann 4.0方法。百分位排名≤0.5和IC₅₀值≤500 nM被视为强结合。使用代表性和常见HLA等位基因面板。MHC-II表位预测使用IEDB共识工具，保留百分位排名<0.5和IC₅₀<50 nM（高亲和力）或<500 nM（中等亲和力）的肽段。线性B细胞表位预测使用BepiPred-2.0顺序B细胞表位预测器。

结果

链球菌外毒素的序列和结构相似性

化脓性链球菌的四种主要外毒素SPEA、SPEC、SPEM和SPEK作为细菌SAg毒素家族代表成员进行分析。尽管长度不同，多序列比对显示所有毒素具有高度一致性评分，反映保守序列。最保守区域涵盖SPEA的157-221位氨基酸及SPEC、SPEM和SPEK中对齐区段，包含12个残基序列对应β链/铰链/α螺旋结构域，该区域在金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌SAgs中高度保守。结构比对也显示外毒素间强烈相似性，尤其在SAg结构域内。

链球菌外毒素与HSPs的广泛序列相似性

每个外毒素与Grp94、HSP90、Grp78、HSP70和HSP60的 pairwise 比对显示，约90%的SPEA、SPEC和SPEM序列与Grp94对齐。SPEM与HSP90（99%）、Grp78（91%）和HSP70（92%）的覆盖度最高。每个外毒素序列大部分被至少两种HSPs的重叠区段覆盖，特别是SPEA和SPEC。长的连续HSP区段（通常超过30个氨基酸）以最小间隙匹配外毒素区域。

与SAg结构域匹配的特异性HSP序列

鉴于SAg结构域的免疫学相关性，检查了重叠该区域的HSP序列。仅包含在 pairwise 比对中与SAg结构域完全对齐的HSP区段。选择标准为区段长度和与多个外毒素的对齐。由于HSPs相对于外毒素长度更大，与多个外毒素共同区域的匹配支持序列显著性。Grp78（544-586残基）和Grp94（534-570）与各种外毒素区段重叠，通常具有内部重叠。HSP70（471-509）与SPEC对齐并部分重叠其SAg结构域。HSP90和HSP60在该区域仅显示稀疏短匹配。

鉴于HSP家族成员间高度序列相似性（Grp94/HSP90：92%；Grp78/HSP70：96%），寻找了对齐HSP序列的同源区段。由此鉴定出额外匹配区段：Grp94 476-505和534-570分别与HSP90 436-456和487-523对齐；反过来，HSP90 450-468和579-596分别匹配Grp94 498-512和630-646。HSP70 471-509对应Grp78 494-532，Grp78 544-573与HSP70 521-550对齐。Grp78 519-539匹配HSP70 499-516，而Grp78 573-586在HSP70中缺乏同源物，将对齐限制到573残基。组合后，Grp78/HSP70中的这些同源序列形成几乎连续的区段（HSP70：471-550；Grp78：494-573），由五个残基间隙分隔。

链球菌外毒素与HSPs间MHC-I表位的相似性

为评估与SAg区域显著相似的HSP序列是否也展现免疫原性潜力，分析了其MHC-I表位含量并与链球菌外毒素比较。前提是外毒素像其他外源蛋白一样被内化到抗原呈递细胞（APCs）中，并与MHC-I和MHC-II分子复合物呈递给TCRs。仅从外毒素和HSPs中选择具有高预测结合亲和力（IC₅₀ <500 nM）的表位。

外毒素表位主要位于N端和SAg区域。虽然在N端观察到孤立表位，但在SAg结构域发现显著的重叠表位浓度：SPEA 173-204中六个，SPEC 157-187中六个，SPEK 182-211中五个，尽管SPEM是最短外毒素，其125-188中甚至有十三个。所有表位均为等位基因特异性，除SPEC和SPEM中各有一个表位结合两个不同等位基因。

在HSPs中，Grp94、HSP90、Grp78和HSP60包含众多表位，而HSP70展现较少总表位但全部集中在SAg相似区域。最频繁靶向的等位基因包括HLA-B40:01和B15:01，后者与几个外毒素表位共享。多个HSP序列包含重叠表位，特别是在Grp94、HSP90、Grp78和HSP70内。

为确定HSP和外毒素表位间重叠，沿先前对齐区域进行MHC-I表位作图。许多HSP表位，特别是在Grp94和HSP70中，与SPEM和SPEA表位紧密匹配。值得注意的是，这些表位位于先前与SAg区域对齐的相同序列内，该区域本身包含密集的重叠表位簇。相比之下，SAg区域外的匹配表位较少且空间孤立，强化了SAg结构域在免疫刺激中的功能显著性。重要的是，Grp78和HSP70的扩展序列，各形成一个长的同源延伸，包含与所有外毒素特别是SPEA、SPEC和SPEM重叠的表位。

虽然Grp94、HSP90和HSP60的一些序列与SAg结构域对齐，但并非所有包含MHC-I表位。例如，与SPEM对齐的Grp94 476-496包含三个表位，而与多个外毒素对齐的更长的534-570区段仅包括在与SPEA对齐的序列534-557中的一个表位。HSP90和HSP60贡献较少匹配表位，分别为两个和一个。总体而言，仅Grp78和HSP70序列提供与所有外毒素免疫优势SAg区域一致且广泛的重叠。

含MHC-I表位的HSP序列的免疫原性

除结合亲和力外，T细胞免疫原性是功能性表位识别的关键决定因素。因此评估了每个与外毒素序列相似的HSP表位的预测免疫原性。仅具有阳性免疫原性评分的表位被视为功能相关，尽管所有具有高MHC-I结合亲和力。

在所有分析肽段中，HSP70序列471-493及其同源Grp78 494-516显示最高免疫原性，包含 distinct 强免疫原性表位。Grp78 547-571及同源HSP70 524-548为中等免疫原性，而Grp78 556-565表位更强效。具有三个重叠表位的Grp94 476-496也显示阳性免疫原性，不同于Grp94 534-570区段和HSP90内所有表位，它们为非免疫原性。HSP60表位显示弱但可检测免疫原性。

因此，仅Grp78和HSP70的选择区域，特别是那些也与外毒素SAg结构域对齐的区域，似乎拥有强免疫原性反应，支持其功能模拟细菌SAgs的潜力。

HSP70和Grp78序列包含多表位类别

虽然细胞毒性T淋巴细胞是抗肿瘤免疫反应的核心，但B细胞和CD4⁺ T辅助细胞对于抗原识别和适应性免疫协调至关重要。为评估与SAg结构域同源的HSP序列的免疫原性潜力，鉴定了这些区域内最具预测性的B细胞和MHC II类表位。平行分析外毒素以进行比较。

Grp94包含几个长B细胞表位，大多数不与其I类免疫原性序列重叠。仅两个残基D477和K479，位于476-496区域内，作为B细胞和I类表位。K479（加粗）是唯一共同残基。相比之下，Grp78的548-559序列及其同源区域HSP70的524-537作为B细胞表位，与I类表位部分重叠，该结果支持Grp78和HSP70同源序列的广泛免疫原性。与HSPs相比，外毒素显示相对有限数量的B细胞表位，重叠的B细胞和I类表位局限于SAg结构域内SPEA、SPEC和SPEM的短区段。

搜索跨七个流行HLA II类等位基因代表面板的高亲和力MHC II类表位（百分位排名≤0.50）鉴定出Grp94残基534-551内四个表位，位于I类免疫原性区域外。值得注意的是，Grp78和HSP70分别包含九个和十一个II类表位。Grp78表位中，六个位于残基496-520内，与HSP70 473-498同源，三个位于序列533-549内。HSP70的十一个表位中，七个映射到残基473-498，四个到520-537，全部在与Grp78 544-573共享的免疫原性471-550区段内。

外毒素，特别是SPEA、SPEM和SPEK，在SAg结构域内具有多个与I类表位重叠的II类表位。这些表位主要结合DRB1 * 03:01（九个表位）和DRB4 * 01:01（七个表位），后者也被Grp78和HSP70表位靶向。发现与DRB5 * 01:01和DRB3 * 01:01的额外重叠，在HSPs和外毒素间共享。Grp78（残基505-549）和HSP70（481-498）具有结合DRB4 * 01:01的II类表位，与SPEA、SPEC、SPEM和SPEK SAg区域内表位识别的相同等位基因。有趣的是，对DRB4 * 01:01的最强结合亲和力在HSP70表位482-497内观察到。类似地，与相应SPEA表位在序列179-193相比，靶向DRB3 * 01:01的Grp78和HSP70表位证明优异结合亲和力。

Grp78和HSP70的同源80残基序列，通过组合原始和交叉匹配区段形成，包含所有三个类别的重叠表位。值得注意的是，区域Grp78 494-520和HSP70 471-498呈现近乎完全的I类和II类表位重叠。额外的重叠B细胞和II类表位从526延伸到559在Grp78，从504到537在HSP70。显著地，在HSP70 517-527内，所有三个类别的表位重合。一个特别免疫原性区段是Grp78中的B细胞表位526-545，也包括三个连续II类表位。该区域包含残基526-539，与SPEA 163-176同源，涵盖SAg结构域 motif ¹⁶⁵TNKKMVTAQELD¹⁷⁶。该SPEA区段也包括两个II类表位，对Grp78表位也结合的相同等位基因具有亲和力。另一个重要区域，HSP70 480-511，在 pairwise 比对中与SPEM 105-136对齐。该SPEM区段，包括SAg motif ¹³⁰FQNRFVT¹³⁶，包含与HSP70 480-493的两个I类表位重叠的I类表位。

更清晰说明Grp78和HSP70序列如何几乎完全由不同类别的重叠表位组成。虽然两个HSP序列的左区域包含几乎相同类型和相似长度的表位，但右区域显示一些差异。具体地，HSP70区段（残基517-545）包括作为MHC-II和B细胞表位的肽段，并且与相应Grp78区段（残基540-568）相比也更广泛与MHC-I表位重叠。

类似地，两个HSP序列的左区域仅与SPEC和SPEM的特定序列相似。相比之下，右区域与更广泛范围的外毒素序列共享相似性。值得注意的是，与HSP70相反，Grp78序列显示与所有外毒素序列更广泛相似性，许多包含多个MHC-I表位。

仔细检查与HSP序列对齐的多个外毒素序列也显示Grp78和HSP70对SPEA（163-217）、SPEC（129-179）和SPEM（105-159）的整体相似性覆盖度多广。该相似性完全涵盖这些外毒素的共享SAg结构域。与SPEK（185-206）的相似性较不广泛，尽管其SAg区域大部分被Grp78覆盖。

HSP70和Grp78的同源免疫原性序列显示与肿瘤抗原5T4和CEA的显著相似性

前述发现支持Grp78和HSP70免疫原性序列拥有触发完整免疫反应的内在能力，可比拟甚至优于链球菌SAg外毒素引发的反应。这些序列，当作为肿瘤Ags呈递时，因此可能具有激活有效抗肿瘤免疫的潜力。尽管广泛实验证据证明其作为肿瘤Ags的作用，HSPs尚未转化为临床使用的诊断或预后生物标志物。为进一步探索此可能性，检查了Grp78和HSP70免疫原性区域是否与临床实践中当前使用的肿瘤相关抗原，即5T4和CEA，展现序列相似性。

滋养层糖蛋白5T4是一种细胞表面抗原，在广泛恶性肿瘤中过表达，在正常组织中表达有限。虽然5T4已被评估为肿瘤免疫治疗靶点，但临床结果仍然 modest。

未观察到5T4与Grp94免疫原性区域476-496间的序列相似性。相比之下，Grp78和HSP70均与5T4展现高评分序列对齐。使用T-Coffee和Clustal Omega进行的 pairwise 比对揭示高度相似性，最强对齐发生在Grp78残基493-504和HSP70 470-479与5T4的283-292区域间。多序列比对进一步确认此观察，当Grp78和HSP70全长序列与5T4对齐时产生超过90%的一致性评分，此结果未在任何其他HSP中复制。

接下来评估了与CEA的序列相似性，CEA是免疫球蛋白超家族中一个充分表征的糖蛋白，在各种癌症中广泛使用的生物标志物。与5T4一样，Grp94未显示与CEA的任何显著相似性。然而，Grp78和HSP70的同源免疫原性序列确实与CEA显示显著对齐。与5T4不同，其中相似性局限于单个区段，CEA展现多个离散相似区域。这与CEA家族的基因组架构一致，其包含一系列编码重复氨基酸 motifs 的串联基因复制。

Grp78序列494-517和547-568，均在更广泛的494-568区域内，与CEA序列对齐，HSP70 471-493区段也显示相似性。此外，HSP70跨越残基524-545的区域与三个其他 distinct CEA序列对齐。当顺序映射时，显示与HSP序列相似的CEA区域揭示HSP70与更广泛CEA区段集合对齐。值得注意的是，虽然HSP序列的左部分（Grp78 493-504和HSP70 470-479）与5T4更相似，但其右部分（Grp78 547-568和HSP70 524-545）证明与CEA更大相似性。

这些发现强化了Grp78和HSP70序列的免疫原性相关性，并支持其通过与临床认可肿瘤抗原的交叉反应参与肿瘤免疫的潜力。

讨论

本研究测试了细菌疗法中观察到的抗肿瘤效应可能源自细菌SAgs与特定作为肿瘤Ags的HSP序列间序列相似性引发的适应性免疫反应的假说。考虑到各种链球菌制剂随时间在癌症治疗中展示的显著影响，选择链球菌外毒素SPEA、SPEC、SPEM和SPEK作为模型SAgs来检验此假说。

众所周知，细菌和病毒SAgs在SAg结构域内共享保守序列同源性，这与 underpins 其强效免疫刺激活性的共同结构构象相关。我们的分析确认链球菌外毒素在SAg结构域及其相邻区域周围展现最高程度的序列和结构相似性，尽管存在个体间序列变异。

比较HSPs与这些细菌外毒素的基本原理源于HSPs在各自家族内跨物种展现广泛序列保守性，并且在各种细菌和病毒感染中被识别为免疫优势抗原的知识。细菌和人类HSPs间的分子模拟由于抗原交叉反应性已被牵涉在不同炎症疾病的发病机制中。此外，几种HSPs，特别是Grp94、HSP90、Grp78、HSP70和HSP60参与各种肿瘤的发展和进展。

Pairwise 比对分析揭示不仅HSPs与外毒素间存在广泛相似性，不被任何无关对照蛋白质共享，而且相似性的最高密度 precisely 发生在SAg结构域区域。某些HSPs，特别是Grp94、Grp78和HSP70，显示广泛关键相似性，在Grp94和Grp78情况下涉及所有测试外毒素的SAg区域与单个不间断序列区段。考虑到HSPs相对于外毒素的不同长度，此发现具有相关性。虽然发现HSP70仅与SPEC对齐，但对齐被认为是显著的，因为它与HSP70的长不间断延伸发生，几乎覆盖整个SAg区域。

鉴于HSPs相同类别内固有序列同源性，我们预期存在额外先前未鉴定的同源序列，展现与外毒素相似程度的相似性。确实，在HSP70和Grp78间以及Grp94和HSP90间找到同源序列，而仅短同源区段在HSP60与 either HSP70或Grp78间鉴定出。这些发现揭示当与它们的同源对应物一起考虑时，Grp78和HSP70形成几乎连续的80氨基酸长序列，未在Grp94或HSP90中观察到的特征，从而强调其潜在功能重要性。

为评估与SAg结构域对齐的HSP序列是否拥有与外毒素可比拟的免疫原性属性，分析了预测的MHC I类和II类表位，以及B细胞表位，在HSPs和外毒素内。结果显示外毒素中的MHC-I表位主要位于SAg结构域内，突出该区域的免疫原性性质并支持其 proposed 内化和由APCs与MHC I类分子复合物呈递。

在HSPs中，仅Grp78和HSP70，以及在较小程度上Grp94，在对齐序列内包含I类表位。值得注意的是，Grp78和HSP70的原始和同源序列包括众多高亲和力MHC-I表位，与所有外毒素的表位重叠。特别是，与SPEC对齐的原始HSP70序列及其在Grp78中的同源物也展现高预测免疫原性评分的肽段。

MHC II类和B细胞表位的进一步分析强化了Grp78和HSP70拥有最高免疫原性潜力的结论。与Grp94对比，这些HSPs不仅包含强I类表位，而且呈现广泛II类和B细胞表位，表明其引发强大体液和细胞免疫反应的能力。源自原始和同源区段的80氨基酸序列完全由免疫原性区域组成：I类和II类表位主要位于N端区域（与对齐SPEC的区段重合），而B细胞表位定位于中央和C端部分。这些B细胞表位重叠或毗邻II类表位，形成结构和功能整合的免疫原性单元。

重要的是，这些表位不仅展现高个体免疫原性，而且证明与外毒素表位的广泛序列相似性。此外，许多来自Grp78和HSP70的II类表位共享与来自外毒素表位相同HLA等位基因的高亲和力结合，表明在抗原呈递水平的功能模拟。

Grp78和HSP70内免疫优势肽段与外毒素SAg结构域对齐并模拟其强效免疫刺激特性的发现具有重要含义。这些HSP衍生序列似乎作为细菌SAgs的内源性类似物，支持人类HSPs可以展现与微生物蛋白质抗原交叉相似性的概念。在链球菌抗肿瘤治疗背景下，似乎SAgs通过引发CD8⁺ T淋巴细胞针对在肿瘤细胞中过表达的HSP衍生表位发挥作用，无论是在细胞表面还是作为循环可溶性抗原。

此机制链接为提出此处鉴定的HSP序列可能作为肿瘤特异性抗原提供基础。虽然各种HSPs以其在癌症生物学中的作用而闻名并被鉴定为肿瘤Ags，但尚未有一个被采纳为临床验证的肿瘤生物标志物。我们观察到 well-established 肿瘤标志物5T4和CEA与Grp78和HSP70免疫原性区域展现实质性序列相似性，为这些HSP序列的抗原性质提供令人信服的支持。此相似性可能反映伴随致癌转化的改变蛋白质加工和表达。HSP基因响应细胞应激的上调，特别是HSP70和Grp94，已知促进肿瘤抗原加工和呈递。HSPs与肿瘤特异性蛋白质的融合或稳定关联可能解释观察到的HSPs与肿瘤标志物如5T4和CEA间高相似性。除了HSP70和Grp78与5T4的全局对齐相似性外，作为 such 值得进一步研究的结果，特别值得注意的是Grp78和HSP70内免疫原性区域与5T4中I类表位紧密对应，并且也维持与CEA的更广泛相似性。

总之，我们深入生物信息学调查鉴定出两个同源Grp78和HSP70序列，紧密模拟链球菌SAg外毒素的免疫优势表位。与两个临床相关肿瘤抗原共享强相似性的额外发现表明这些HSP序列可能作为共享肿瘤抗原，能够引发强效免疫反应，类似于SAg外毒素触发的反应。尽管这些计算机发现对肿瘤免疫学具有广泛影响——特别是在疫苗和肿瘤生物标志物开发中——但在解释它们具有立即转化相关性时需谨慎。我们研究的一个关键限制是缺乏验证任何生物信息学预测所需的体外或体内实验。

虽然HSPs是 obligatory 细胞内蛋白质，因此被免疫系统忽略，但不能排除其偶尔表面表达或与细胞外成分的分子模拟，特别是在外源性HSPs给药后。因此，除了免疫宿主以评估对这些HSP序列的特异性免疫反应外，未来研究还应考虑与施用高免疫原性HSPs相关的自身免疫反应潜在风险。