基于机器学习与分子模拟揭示Arctigenin通过靶向SRC激酶抑制三阴性乳腺癌的双通路机制

本研究发现天然化合物Arctigenin（AG）通过直接结合SRC激酶，双重抑制PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路，诱导三阴性乳腺癌（TNBC）细胞周期阻滞与线粒体凋亡。研究整合机器学习算法（LASSO/SVM-RFE/RF）、分子对接（结合能-7.777 kcal/mol）、分子动力学（200 ns模拟）及表面等离子共振（KD=71.8 μM）等多维技术，证实AG显著抑制MDA-MB-453/231细胞活力（CCK8法），下调p-PI3K/p-AKT/p-MEK/p-ERK表达（Western blot），为TNBC靶向治疗提供新策略。

　　

引言

三阴性乳腺癌（TNBC）因缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人类表皮生长因子受体2（HER-2）表达，导致治疗选择有限且预后较差。当前化疗方案伴随心脏毒性、骨髓抑制等副作用，且易产生耐药性。天然化合物Arctigenin（AG）源自牛蒡子，具有广谱抗肿瘤活性，但其在TNBC中的作用机制尚未明确。本研究通过整合多组学数据与计算生物学方法，系统探索AG抗TNBC的分子靶点与信号通路调控机制。

材料与方法

研究从PubChem、SwissTargetPrediction和PharmMapper数据库获取AG的潜在靶点（183个），同时从TCGA数据库筛选TNBC差异表达基因（DEGs，5193个）和加权基因共表达网络（WGCNA）模块基因（6173个）。通过交集分析获得28个关键基因，并进行GO/KEGG富集分析。采用三种机器学习算法（支持向量机递归特征消除SVM-RFE、最小绝对收缩与选择算子LASSO、随机森林RF）筛选枢纽基因，并通过分子对接（Glide软件）、分子动力学模拟（AMBER 22，200 ns）和表面等离子共振（SPR）验证结合特性。体外实验使用MDA-MB-453和MDA-MB-231细胞系，通过CCK8法检测细胞活力、流式细胞术分析细胞周期与凋亡、Western blot检测蛋白表达。

结果

靶点筛选与功能富集

GO分析显示28个交集基因显著富集于细胞周期G2/M期转换、纺锤体极组装、丝氨酸/苏氨酸激酶活性等生物学过程。KEGG通路分析提示这些基因参与细胞周期、孕酮介导的卵母细胞成熟、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等通路。

机器学习确定枢纽基因

SVM-RFE、LASSO和RF算法分别筛选出23、13和10个核心基因，取交集后获得4个枢纽基因：AURKA、SRC、PLK1和CDC25C。ROC曲线显示这些基因在区分TNBC与正常组织中的AUC值均高于0.83（SRC:0.833, AURKA:0.994, CDC25C:0.983, PLK1:0.989），表明其诊断潜力。

分子对接与结合机制

AG与SRC、PLK1和AURKA的结合能分别为-7.777 kcal/mol、-7.690 kcal/mol和-7.685 kcal/mol，与CDC25C结合较弱（-5.185 kcal/mol）。AG与SRC的结合模式中，其氧原子与M341的氧原子和G344的氮原子形成氢键。分子动力学模拟显示结合自由能（MM/GBSA法）为-26.66 ± 3.75 kcal/mol，其中范德华能（ΔE_vdw）为主要贡献项（-34.85 ± 5.19 kcal/mol）。关键残基包括G274、V281、M314、S345和G344。SPR实验证实AG与SRC的结合解离常数KD为71.8 μM，结合速率常数k_a为6.95 × 10² M^?1·s^?1，解离速率常数k_d为4.99 × 10^?2 s^?1。

体外实验验证

AG以浓度和时间依赖性方式降低MDA-MB-453和MDA-MB-231细胞活力（CCK8法）。流式细胞术显示AG处理导致S期细胞比例增加（G0/G1期减少），Western blot检测到CDK2和Cyclin A2表达下调，Cyclin E1表达上调。凋亡实验表明AG引起线粒体膜电位（MMP）去极化（JC-1染色）、caspase-3活性升高（荧光显微镜），并增加晚期凋亡/坏死细胞比例（Annexin V-FITC/PI染色）。蛋白分析显示Bcl-2、pro-caspase-3和pro-caspase-9表达下降，cleaved caspase-3和cleaved caspase-9水平上升，Bax表达无显著变化。信号通路蛋白检测证实AG处理后SRC、p-PI3K-p85、p-AKT1、p-MEK1/2和p-ERK1/2表达均浓度依赖性降低，而总PI3K、MEK1/2和ERK1/2未受影响。

讨论

本研究通过多学科交叉策略揭示AG抗TNBC的核心机制：直接靶向SRC激酶，同步抑制PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路，诱导S期阻滞与线粒体依赖性凋亡。SRC作为非受体酪氨酸激酶，在TNBC中过度激活并促进细胞增殖与存活。AG与SRC的中等结合 affinity（KD=71.8 μM）符合天然化合物的特性，其可逆结合模式可能有利于动态调控信号通路。下调的CDK2/Cyclin A2复合物导致DNA合成受阻，而Bcl-2/caspase通路激活则触发凋亡程序。近候选基因（如CLK1、PDGFRB、MMP13等）的多次筛选提示其潜在功能，值得进一步探索。研究局限性包括未开展救援实验验证通路必要性，以及缺乏体内模型评估临床转化潜力。

结论

AG通过特异性结合SRC激酶，双重抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK信号轴，有效阻断TNBC细胞增殖并诱导凋亡。该研究为开发基于天然化合物的SRC靶向疗法提供了理论依据与实验支撑。