具核梭菌（Fusobacterium nucleatum）在结直肠癌中塑造免疫抑制微环境的空间与分子机制研究

本回顾性队列研究深入探讨了具核梭菌（Fn）在结直肠癌（CRC）中的临床意义与免疫调控机制。研究发现Fn阳性（Fn+）肿瘤与低分化显著相关，并通过空间转录组与成像质谱流式技术（IMC）揭示了其介导的免疫抑制微环境特征，为靶向菌群干预CRC治疗提供了新视角。

　　

1 引言

结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）是全球重大的健康问题，其发病率和死亡率均位居恶性肿瘤前列。除年龄和遗传因素外，环境因素如饮食、缺乏运动、吸烟、肥胖、饮酒和抗生素使用等，均可通过改变肠道菌群，促进富含病原体（如大肠杆菌、沙门氏菌和具核梭菌）的生态失调环境形成。

具核梭菌（Fusobacterium nucleatum, Fn）是一种革兰阴性厌氧杆菌，常见于口腔和胃肠道，与牙周炎相关。它是一种兼性胞内菌，可在特定条件下侵入宿主细胞，通过逃避免疫应答和抑制凋亡，在肿瘤微环境中持续存在，促进慢性炎症和癌症进展。多项研究报道Fn在结直肠腺瘤患者粪便样本中水平升高，且在CRC患者粪便菌群中更为普遍。Fn可从口腔经血流（如牙科治疗期间）或通过肠道顺行定植并侵入黏膜屏障受损的肿瘤细胞到达结直肠癌部位。

Fn丰度随CRC分期增加而上升，更常见于右侧肿瘤，后者常具有高度微卫星不稳定性/错配修复缺陷（MSI/dMMR）、CpG岛甲基化表型（CIMP）和BRAF突变特征，提示Fn在CRC发生发展中起关键作用。Fn可能通过诱导促炎细胞因子（如IL-8、CXCL1）、招募免疫抑制细胞和上调PD-L1表达促进肿瘤发生，这些机制有助于免疫逃逸和促肿瘤微环境形成。

鉴于Fn在CRC进展中的重要作用，深入研究其对CRC免疫原性的影响至关重要。本回顾性队列研究旨在通过评估（i）Fn流行率及临床病理学关联，（ii）分析MSS/pMMR直肠癌的转录差异，（iii）通过成像质谱流式（IMC）量化空间免疫相互作用，及（iv）评估转移灶中Fn的持续性，以探讨Fn在CRC中的作用。

2 材料与方法

本研究回顾性收集了2005年至2017年间在奥地利萨尔茨堡帕拉塞尔苏斯医科大学内科学III系诊断和/或治疗的107例经组织学 confirmed的局限性CRC患者数据。排除同步转移患者。其中47例直肠癌患者均接受新辅助长程放化疗（使用卡培他滨作为放射增敏剂），其余60例局部晚期结肠癌患者接受原发手术及辅助化疗（方案包括卡培他滨+奥沙利铂、氟尿嘧啶+奥沙利铂或卡培他滨单药，依据肿瘤分期、体能评分和年龄决定）。从医疗记录中提取以下数据：1）患者特征（性别、诊断年龄、末次随访或死亡日期）；2）肿瘤特征（原发部位左/右、分期、组织学分级、转移检测时间点、转移分布模式及预测生物标志物如微卫星/错配修复状态）；3）（全身）治疗。

2.1 统计分析

使用STATA BE 18.0进行数据收集与分析，统计显著性设定为P≤0.05。分类数据采用列联表和卡方检验比较，连续数据以中位数和范围总结，组间比较使用Mann-Whitney检验。采用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验评估组间无病生存（DFS）和总生存（OS）。DFS从手术日期至局部复发、远处转移检测或死亡计算，OS从CRC诊断日期至任何原因死亡计算，存活患者在末次接触时截尾。

2.2 病理染色与分析

对4μm厚福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片进行免疫组化分析。使用Ventana Benchmark Ultra仪器（Ventana Medical Systems）进行Fn免疫染色（抗体克隆ABIN4888518，Diatheva S.R.L.）。错配修复蛋白免疫染色使用Dako Omnis Autostainer结合EnVision Plus系统（Dako），采用抗MLH1、MSH2、MSH6和PMS2即用型抗体。所有染色操作由两位经验丰富的病理学家执行。

2.3 Fn的分子遗传学分析

用于分子分析的标本取自肿瘤治疗前的诊断活检。由于组织保存和可用材料差异，结肠癌样本采用DNA-based qPCR检测Fn，直肠癌样本采用RNA-based qPCR检测。为确保检测稳健性，应用一致的循环条件、验证引物特异性并排除低质量样本。Fn⁺与Fn^?肿瘤的比较分析按队列分层以考虑方法学差异。

2.3.1 RNA测序

将总RNA提交至因斯布鲁克医科大学多组学测序核心设施（MultiOmics-Seq Core Facility）进行基因表达分析。使用QuantSeq 3’-mRNA文库制备试剂盒（Lexogen GmbH）构建文库，遵循制造商说明并针对FFPE来源RNA的交联效应变异进行修改：包括85°C变性（步骤2）、调整cDNA大小选择（步骤16, 48μl PS）和文库大小选择（步骤29, 30μl PB）。最终扩增分两步进行，中间插入AMPure珠（Becton Dickinson Austria GmbH）纯化步骤，洗脱18μl中取16μl用于第二轮扩增，总计13+6个PCR循环。最终文库多重混合后使用Illumina NovaSeq技术测序。

2.3.2 结肠癌队列

FFPE样本（每样本2-4张10μm切片）经二甲苯脱蜡后，使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）提取基因组DNA，遵循制造商协议。DNA纯度用NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测量，浓度通过Qubit荧光计（Thermo Fisher Scientific）测定。使用TB Green Premix Ex Taq II（TAKARA Bio）进行qPCR以确定Fn存在（靶向Fn的NusG基因和人类内参基因PCBP1）。引物对Fn特异，且对坏死梭杆菌无交叉反应（补充材料表S1）。每反应至少使用10ng基因组DNA模板，所有反应在LightCycler 96热循环仪（Roche）上重复进行50个循环[初始变性（95°C, 30s），50×变性（95°C, 5s），退火（58°C, 10s）和延伸（72°C, 30s）；最终延伸（72°C, 60s）和熔解曲线分析（95°C 10s, 65°C 60s, 97°C 1s）]。通过凝胶电泳、测序和熔解曲线确认产物特异性。至少15%患者样本进行重复实验，结果高度一致。排除DNA质量差或熔解曲线不清晰样本（n=25），最终结肠癌队列纳入60样本。

为确定PCR对Fn的敏感性，用阴性患者DNA加标Fn gDNA（范围0.3ng ~约128,000拷贝至3×10^-7 ng/0.18拷贝）。qPCR可可靠检测至少100拷贝细菌DNA。通过计算细菌与人类细胞比值进行负荷分类。

2.3.3 直肠癌队列

每样本4张10μm FFPE切片用Qiagen脱蜡溶液（cat. No. 19093）脱蜡，使用RNeasy FFPE Kit（cat. No. 73504; Qiagen GmbH）提取总RNA，遵循制造商建议包括DNase-1处理。RNA纯度用NanoDrop测量，Qubit荧光计检测无残留基因组DNA。RNA完整性通过Bioanalyzer pico-RNA技术（Agilent Technologies GmbH）评估。使用RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific）以随机六聚体反转录RNA，遵循制造商说明。加入0.1 M NaOH和HCl降解模板RNA并中和。每样本使用至少300ng RNA。

qPCR采用与结肠癌队列相同循环条件，仅退火温度改为61°C。每反应使用40-125ng cDNA模板。排除低质量样本（n=14），最终n=47。

Fn NusG的定量周期（Cq）值归一化至活检中人类管家基因RPLP0的Cq值。通过减去人类DNA的Cq值计算Fn的Cq值差异，进而计算倍差（2^{-(Cq Fn NusG – Cq RPLP0)}）。详情见补充方法（补充材料，补充图S4、S5）。

2.3.4 批量RNA测序分析

2.3.4.1 预处理

33例微卫星稳定直肠腺癌的RNA测序样本经预处理并使用nf-core/rnaseq流程v3.14.0映射至人类参考基因组（hg38/GRCh38）。简要而言， reads用Trimgalore修剪，使用STAR（v2.7.9a）和GENCODE v46注释比对至参考基因组。基因表达使用Salmon方法（v1.10.0）量化。所得基因计数表使用R v4.4.1进一步处理。后续分析仅纳入Fn测量高置信度（13例Fn^?和6例Fn⁺）和/或良好置信度（9例Fn^?和4例Fn⁺）样本，共22例Fn^?和10例Fn⁺样本。

2.3.4.2 差异基因表达与基因集富集分析

使用DESeq2 v1.44.0进行Fn⁺与Fn^?样本间的差异基因表达分析，在线性模型中纳入性别作为协变量。基因定义为差异表达基于阈值|log₂倍变化| > 1且调整后p值 < 0.1。使用EnhancedVolcano包v1.22.0生成火山图可视化差异表达结果。使用clusterProfiler包v4.12.6进行基因集富集分析（GSEA），利用Gene Ontology-Biological Process数据库。

2.3.4.3 成像质谱流式与数据分析

在19例微卫星稳定CRC样本（10例Fn^?，9例Fn⁺）的组织微阵列上如前述进行IMC（补充材料表S2）。每样本根据组织可用性消融一或两个1000×1000μm感兴趣区域（ROI）。图像经视觉检查并使用MCD? viewer软件（standard biotools）导出为ome.tiff。图像标准化、细胞分割和表型鉴定如前述进行，步骤经原始图像验证。

IMC的ROI选择在与病理学家协作构建的组织微阵列芯中，确保代表肿瘤区域，重点关注含活力肿瘤细胞和基质的区域。ROI选择基于高肿瘤细胞性并排除坏死、折叠或降解组织。选择过程对Fn状态设盲以最小化选择偏倚。每样本分析约1mm²的一或两个ROI。

表型分类使用无监督k均值聚类。初始数据过度聚类，随后基于重叠蛋白表达谱手动合并簇。合并期间应用最小信号阈值0.1（缩放至0-1）。所有所得簇针对原始图像文件进行质量检查，以确认单细胞内共表达并排除重叠细胞伪影。使用每表型的标记物表达热图验证簇身份，该热图可解读为混淆矩阵。

仅纳入Fn状态明确定义的样本：Fn⁺样本（高或中等细菌负荷）和Fn^?样本（无检测到负荷）。因分类模糊性排除低负荷样本。

2.3.4.4 使用成像质谱流式数据分析空间细胞组织

为分析细胞空间组织，基于所有检测到核的中心坐标构建Voronoi图。每个Voronoi区域分配至相应细胞类型。直接细胞-细胞相互作用定义为共享Voronoi边且核中心-中心距离小于100μm的细胞对。为评估免疫细胞浸润，计算每样本的免疫细胞-肿瘤细胞混合评分。该评分通过直接免疫细胞-肿瘤细胞相互作用数除以总直接免疫细胞相互作用数确定。此方法亦用于量化抗原呈递细胞（树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、浆细胞和肿瘤细胞）与T细胞（CD8⁺细胞毒性T细胞和CD4⁺辅助T细胞）间的相互作用。Fn⁺与Fn^?间差异的统计显著性使用Wilcoxon检验评估。

3 结果

3.1 患者特征

整个队列中，基于qPCR结果，45例患者分类为Fn⁺，62例为Fn^?。细菌负荷分类基于人类基因组拷贝与Fn基因组拷贝比值（比值：2^{-(Cq Fn - Cq PCBP1)}）。患者依据与人类DNA拷贝比较的高和低细菌负荷分类（图1）。

表1展示了107例CRC患者基于PCR确定Fn状态的患者和肿瘤特征。诊断时平均年龄62.5岁（范围28-84岁），男性居多（61%）。多数患者（69%）为左侧肿瘤（从直肠至横结肠远侧1/3）。肿瘤主要分类为UICC III期（89%）。组织学1级和2级最常见（65%）。47例直肠癌患者中，3例（6%）检测到MSI/dMMR，12例（26%）无法分析微卫星/错配修复状态。7例（15%）新辅助放化疗后达到完全病理缓解（pCR）。Fn⁺与Fn^? CRC间发现肿瘤分级存在统计学显著差异（p=0.008），表明低分化CRC病例更可能为Fn⁺。这些结果与既往发现一致，提示Fn⁺ CRC更常呈现更高肿瘤分级。其余基线患者和肿瘤特征在Fn⁺与Fn^?患者间无差异。

3.2 临床结局

整个队列（结肠癌和直肠癌）的10年OS和DFS分别为68%和62%（补充材料图S1A、B）。27例患者（25%）在随访期间发生异时转移。转移部位降序排列为肝（16%）、肺（8%）、远处淋巴结（6%）、腹膜（6%）、骨（2%）和中枢神经系统（1%）。8例患者（8%）出现局部复发，其中6例同时发生远处转移。

结肠癌亚组10年OS和DFS分别为68%和61%（补充材料图S2A、B），直肠癌亚组分别为65%和63%（补充材料图S3A、B）。

按Fn状态分层时，CRC细胞中Fn存在未显著影响生存结局。图2A的Kaplan-Meier曲线仅显示Fn⁺患者（78%）相比Fn^?患者（61%）有更长OS趋势（log-rank p=0.0990）。10年DFS组间无差异，Fn⁺为65%，Fn^?为60%，如图2B所示（log-rank p=0.5947）。Log-rank检验在整个随访期进行，比较Fn⁺与Fn^?间的完整Kaplan-Meier生存曲线。

3.3 组织学发现

PCR评估为Fn⁺原发肿瘤的9例患者子集进一步进行免疫染色分析。在此示例性队列中，5例通过免疫组化显示原发肿瘤和区域淋巴结Fn⁺，3例样本因FFPE质量不足无法测量，1例样本PCR阳性但免疫组化Fn阴性。

3.3.1 Fn在转移灶中的持续性

PCR和IHC评估为Fn⁺原发肿瘤的9例患者中，3例发生异时转移。所有3例中，Fn均在原发肿瘤和转移部位（包括远处淋巴结、腹膜和肝）检测到（图3）。图版A和B显示原发肿瘤中Fn阳性核染色，图版C和D展示肝转移中类似染色模式。

3.3.2 胞外定位

图4展示一例Fn⁺ CRC代表性病例，细菌位于胞外。图版A显示肿瘤溃烂腔面Fn阳性免疫染色（20×放大），图版B（600×）确认Fn存在于生物膜内。值得注意的是，图版C和D显示原发肿瘤或肝转移肿瘤细胞中无Fn信号，尽管qPCR检测到高细菌负荷。

3.3.3 间质表型

图5呈现Fn⁺ CRC细胞显示符合上皮-间质转化（EMT）的细胞形态学特征。图版A中，升结肠肿瘤细胞显示拉长核和阳性核Fn染色。图版B显示腹膜转移中同时存在间质样和腺泡状肿瘤细胞表型，Fn信号定位于间质样细胞的核。

3.4 分子遗传学发现

3.4.1 混合评分

为研究肿瘤微环境内不同细胞类型间的空间关系，对Fn⁺和Fn^?直肠癌MSS/pMMR样本的组织微阵列进行IMC。分析区域包括瘤内（Fn⁺ n=7, Fn^? n=6）和浸润边缘（Fn⁺ n=7, Fn^? n=9）。随后采用Voronoi镶嵌法，一种基于核位置定义细胞边界的几何方法，通过评估Voronoi多边形的共享边量化直接细胞-细胞相互作用。图6提供免疫细胞和肿瘤细胞此空间映射的视觉示例。

为量化肿瘤微环境内特定细胞-细胞相互作用，借鉴Keren等人方法并开发两种混合评分，代表免疫细胞与肿瘤或抗原呈递细胞直接相互作用的比例。这些评分基于细胞邻近性量化不同细胞类型间的相互作用程度（补充材料表S3）。

计算免疫细胞-肿瘤细胞混合评分以评估免疫细胞浸润程度及其与肿瘤细胞的相互作用，如图7所示。该评分代表直接免疫细胞-肿瘤细胞接触数与总免疫细胞相互作用数之比。统计分析显示，虽然所有组织区域的整体免疫细胞-肿瘤细胞混合在Fn⁺肿瘤中无显著差异（图7A），但在瘤内区域观察到显著增加。Fn⁺肿瘤在肿瘤核心内呈现更高程度的免疫细胞-肿瘤细胞相互作用，如图7B所示，提示免疫浸润增加和与肿瘤细胞的潜在接触。肿瘤边缘未观察到显著差异（图7C），表明两组周边相互作用水平相似。

其次，使用类似评分方法量化抗原呈递细胞（APC）与T细胞（CD8⁺和CD4⁺）间的相互作用（图8）。APC-T细胞混合评分在Fn⁺肿瘤整体未显著增加（图8A），但在瘤内区域显示明显升高（图8B）。肿瘤边缘再次无显著差异（图8C）。

3.4.2 Fn高流行与免疫相关通路抑制相关

为检查Fn⁺或Fn^? MSS/pMMR样本的转录差异，进行上述批量RNA测序数据的差异基因表达分析，鉴定出85个表达水平统计学显著差异的基因（补充材料图S6）。

为深入探索这些转录变化的功能影响，使用Gene Ontology-Biological Process数据库进行基因集富集分析（GSEA）。免疫相关通路在Fn⁺样本中显著抑制，包括“免疫应答调节细胞表面受体信号通路”、“抗原受体介导信号通路”和“B细胞受体信号通路”显著下调，如图9脊线图可视化。

此外，GSEA结果提示抗菌防御机制相关通路显著下调，这与Fn⁺样本中观察到的胞内细菌背景一致。图9总结了Fn⁺肿瘤中免疫和抗菌通路的转录抑制。

4 讨论

本队列（主要含III期CRC患者n=89）的临床生存数据（图1，表1）证实了Salvucci等人对未选择Fn组分析的结果，并与既往研究一致。既往研究表明生物膜增强细菌持续性和耐药性，促进炎症性肿瘤微环境。Fn作为兼性胞内菌，可在宿主细胞内和外存活，尽管大多数分子分析不区分这些定位。这一发现可能对进一步研究有意义，因其提示CRC患者中Fn的胞内和胞外效应存在潜在变异性。

Fn通过抑制抗肿瘤免疫和促进促炎反应调节肿瘤微环境。这包括M2巨噬细胞、髓源性抑制细胞和Th17细胞增加， alongside CD4⁺和CD8⁺ T细胞减少。Fn丰度与PD-L1上调和检查点抑制反应差相关。胞内，Fn可能通过外泌体介导的药物外排诱导化疗耐药，并激活致癌通路如Wnt/β-catenin，促进EMT和转移。

尽管空间分析受样本量限制，Fn⁺肿瘤在肿瘤核心内展示免疫-肿瘤-APC相互作用增加，提示潜在但可能功能失调的T细胞活化。这伴随基因表达分析中抗菌防御通路抑制，可能通过减少宿主抗菌反应支持Fn持续性。值得注意的是，这些免疫学改变未转化为OS或DFS的显著差异，突显了免疫细胞邻近性与有效抗肿瘤免疫间的潜在脱节。

为调和此明显矛盾与观察到的免疫相关通路下调，我们提出空间区室化免疫功能障碍模型：Fn⁺肿瘤可能在浸润边缘呈现T细胞排斥，限制免疫细胞 access，而肿瘤核心内免疫细胞功能损伤阻止有效抗肿瘤应答。此双重机制可解释免疫细胞邻近性增加而无相应活化，值得在未来前瞻性研究中进行功能验证。

我们关于Fn在结直肠转移灶中持续性的观察支持Casasanta等人的发现，他们亦证明Fn在癌细胞内转移的潜力。Greco等人进一步提示Fn与MSI/dMMR和CIMP表型肿瘤相关，并有助于免疫逃逸和化疗耐药。这些发现与我们的一起，支持Fn不仅在转移灶中持续存在且有助于形成 favor 免疫逃逸和治疗抵抗的肿瘤微环境的模型。

虽然广谱抗生素可消除Fn，但耐药性和菌群破坏的担忧凸显了选择性方法的必要性。有前景的临床前策略包括噬菌体?TCUFN3和抗菌肽FP-100，它们在实验模型中显示靶向Fn而不损害微生物多样性的潜力。尽管这些方法在临床前模型中充满前景，它们仍处于研究阶段，尚未在临床试验中评估。未来研究对评估其在CRC患者中的安全性、效力和治疗相关性至关重要。

5 局限性

尽管这些发现有趣，解释结果时需考虑本研究的若干局限性。首先，相对小的样本量限制了统计效力并可能影响发现的普适性。此外，患者异质性 regarding 肿瘤位置（结肠 vs. 直肠）、分期和治疗（如辅助化疗 vs. 新辅助放化疗）可能引入影响观察结局的变异性。

通过免疫染色检测CRC组织中胞内Fn具有挑战性，因肿瘤组织内细菌负荷低，可能导致假阴性结果。抗Fn核染色可能非特异，应谨慎解读。结肠癌和直肠癌队列中使用不同分子模板和参考基因进行Fn检测可能引入细菌负荷量化的变异性。具体而言，这些方法使用 distinct 参考基因（结肠癌DNA-based检测用PCBP1，直肠癌RNA-based检测用RPLP0），可能影响队列间直接可比性。尽管两种 assay 内部验证，队列间直接比较应谨慎解读。未来研究可能受益于统一检测方案或跨平台校准。

大量样本缺乏微卫星/MMR状态和BRAF/KRAS突变数据，主要因微卫星/MMR状态常规检测在2017年前未一致实施，且BRAF/KRAS突变数据在局限性疾病中非常规评估。

此外，研究回顾性性质限制建立因果关系的能力，发现应视为探索性和假设生成性。值得注意的是，尽管免疫学改变显著，生存差异不显著可能归因于混杂临床变量如治疗异质性、肿瘤定位和样本量限制。

6 结论与展望

总之，Fn有助于形成损害抗菌防御和抗肿瘤免疫的免疫抑制微环境。尽管Fn⁺状态在本队列中未影响临床结局，其在促进肿瘤增殖、化疗耐药和转移发展中的作用强调测试Fn指导治疗策略的必要性。选择性消除Fn可能增强现有疗法效力并降低复发风险，但此假设需通过前瞻性研究进行临床验证。