年龄通过细胞衰老相关分泌表型（SASP）影响小鼠股骨近端骨折愈合的机制研究

本文探讨了年龄对小鼠股骨近端骨折愈合的影响，揭示了中年（52周龄）小鼠相较于年轻（12周龄）小鼠表现出骨量减少（osteopenic phenotype）、软骨形成减少、骨形成受损以及细胞衰老标志物（如p21+细胞和SASP因子IL-6、CCL-5、CCL-2）上调的现象。该研究为理解年龄相关性骨折愈合延迟的分子机制提供了重要依据，并证实了该动物模型在相关研究中的适用性。

　　

引言

骨质疏松性骨折是导致疼痛和功能障碍的重要原因，尤其在老年人群中更为常见。骨质疏松会导致骨稳定性丧失，进而增加骨折风险，特别是在干骺端区域。此外，机体的愈合能力也会随年龄增长而减弱，导致骨折后恢复时间延长。然而，其潜在机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨年龄对小鼠股骨近端骨折模型的影响，并评估该模型是否适用于研究年龄相关性骨折愈合延迟的分子机制，包括细胞衰老的标志物如CDK抑制剂和SASP因子。

方法

动物与实验设计

研究使用12周龄和52周龄的雄性C57BL/6J小鼠。所有动物实验均经当地动物福利委员会批准，并按照国际实验室动物福利和处理规定进行。手术在全身麻醉下进行，术后动物可自由活动。分别在骨折后6小时、24小时、14天和21天处死小鼠，收集血肿和骨折股骨进行后续分析。

手术过程

采用开放式截骨术在股骨近端制造骨折，并通过髓内钉进行固定。手术过程标准化，确保骨折位于小鼠小转子和第三转子之间，与骨质疏松患者的股骨转子间骨折类似。

多重细胞因子分析

使用血肿样本进行多重细胞因子分析，测定包括KC（CXCL1）、IFNγ、IL-10、IL-6、MCP1/CCL2、MIP1a和CCL5等炎症介质的水平。

μCT分析

使用μCT扫描分析骨折愈伤组织的骨体积（BV）、总体积（TV）、骨体积分数（BV/TV）和骨矿物质密度（BMD）。同时，对完整胫骨的骨小梁参数进行评估。

组织学分析

骨折股骨和完整胫骨进行脱钙组织学处理，通过番红O染色评估愈伤组织的组织成分，包括骨组织、软骨组织和纤维组织的比例。

免疫组化和免疫荧光染色

使用特异性抗体检测胶原X（Col X）、骨钙素（OC）、IL-6、p21、CCL5等蛋白的表达，并通过评分系统或绝对细胞数进行量化。

空间转录组学

使用Visium空间转录组技术对骨折后14天的股骨切片进行基因表达分析，检测与软骨形成、骨形成和炎症反应相关的基因表达。

统计分析

使用GraphPad Prism 10进行统计分析，学生t检验用于比较两组之间的差异，显著性水平设定为p < 0.05。

结果

中年小鼠完整胫骨的骨质疏松表型

μCT分析显示，52周龄小鼠的胫骨骨小梁数量（tbN）显著减少，骨小梁间距（tbSp）增加，骨小梁厚度（tbTh）增加，但骨小梁骨矿物质密度（tbTMD）和骨体积分数（BV/TV）无显著差异。组织学分析发现，中年小鼠的成骨细胞数量（NOb/BPm）和活性（ObS/BS）显著降低，骨细胞数量（NOct/BA）减少，破骨细胞数量（NOc/BPm）增加。此外，骨髓中IL-6阳性细胞评分显著升高。

骨折后的炎症反应

多重细胞因子分析显示，骨折后6小时，中年小鼠的KC和IL-6水平显著降低，而CCL5水平显著升高。24小时后，KC和IL-6水平在中年小鼠中显著升高，IL-10水平降低。这些结果表明，中年小鼠的炎症反应延迟且持续时间更长。

年龄对愈伤组织结构的影响

骨折后14天，中年小鼠的愈伤组织总体积（TV）和骨体积（BV）显著减少，软骨组织比例（cA/tA）降低，纤维组织比例（fA/tA）增加。胶原X阳性区域在年轻小鼠中趋势更高。21天后，愈伤组织总体积无显著差异，但中年小鼠的骨组织比例（bA/tA）降低，纤维组织比例升高，胶原X阳性区域仍呈减少趋势。

年龄对细胞水平的影响

骨折后14天，中年小鼠的破骨细胞数量（NOc/BPm）和成骨细胞数量（NOb/BPm）均显著减少，成熟成骨细胞（表达骨钙素）的数量和活性也降低。21天后，总成骨细胞和破骨细胞参数无显著差异，但成熟成骨细胞的数量和活性仍显著降低。

细胞衰老标志物

免疫组化分析显示，中年小鼠骨折后14天和21天的骨髓中p21阳性细胞评分显著升高，皮质骨和愈伤组织中p21阳性细胞数也增加。IL-6和CCL5在中年小鼠骨髓中的表达显著上调，皮质骨中CCL5阳性细胞数也增加。p16阳性细胞数无显著差异。

空间转录组学分析

空间转录组学显示，中年小鼠的Mmp13（肥大软骨细胞标志物）和Dmp1（成熟成骨细胞和骨细胞标志物）表达降低，Acp5（TRAP编码基因）表达减少，CXCL12表达降低，CCL2表达升高。CCL5和IL-6的基因表达水平无显著差异。

讨论

本研究证实了中年小鼠在完整胫骨中表现出骨质疏松表型，包括骨小梁数量减少、成骨细胞活性降低和破骨细胞数量增加。骨折后，中年小鼠的炎症反应延迟且持续时间更长，愈伤组织形成受损，软骨和骨组织比例减少，纤维组织比例增加。细胞水平上，成骨细胞和破骨细胞活性降低，成熟成骨细胞数量减少。此外，细胞衰老标志物（如p21、IL-6和CCL5）在中年小鼠中显著上调，空间转录组学进一步揭示了基因表达水平的差异。

这些发现表明，年龄通过促进细胞衰老和SASP因子的分泌，抑制骨折愈合过程。本研究为理解年龄相关性骨折愈合延迟的机制提供了重要依据，并证实了股骨近端骨折模型在相关研究中的适用性。

研究局限性

本研究存在一些局限性。首先，小鼠的解剖结构和生物力学与人类存在差异，因此需要在大型动物模型中进行验证。其次，中年小鼠的干骺端骨小梁较少，增加了实验操作的难度和变异度。此外，本研究仅使用雄性小鼠，未能评估性别对骨折愈合的影响。未来研究应进一步探讨老年动物和雌性动物的骨折愈合过程。

结论

本研究证实了年龄对小鼠股骨近端骨折愈合的负面影响，表现为骨形成减少、软骨形成受损和细胞衰老标志物上调。这些发现为开发针对年龄相关性骨折愈合延迟的治疗策略提供了理论基础。