小胶质细胞重编程重塑免疫微环境促进脑卒中后功能恢复的机制研究

本研究发现急性期PLX5622介导的小胶质细胞（microglia）清除与再殖可显著改善缺血性脑卒中（tMCAO）预后。再殖小胶质细胞呈现稳态表型（homeostatic phenotype），通过抑制趋化因子（Ccl2/Ccl3/Ccl4等）分泌、增强血脑屏障（BBB）完整性（VCAM1+/ICAM1+内皮细胞减少）及重编程浸润免疫细胞（T细胞耗竭减弱、吞噬型巨噬细胞GPNMB+增多），最终建立促修复微环境。该时序性免疫调控策略为卒中治疗提供新方向。

　　

1 引言

脑卒中是全球致残和致死的主要病因之一。尽管血管再通治疗技术在早期阶段取得进展，但超过50%的患者仍遗留中重度功能障碍。持续存在的神经炎症反应和神经元丢失是导致继发性损伤的关键因素。缺血后大量免疫细胞浸润至梗死区域并长期滞留，形成持续的炎症微环境。因此，免疫调节成为极具前景的治疗策略。

小胶质细胞作为大脑常驻免疫细胞，在卒中进展中发挥双相作用：急性期启动炎症反应并促进外周免疫细胞招募，后期则向修复型转变。然而，小胶质细胞的持续过度激活会阻碍免疫微环境向修复状态转变。研究表明，集落刺激因子1受体（CSF1R）抑制剂PLX5622可选择性抑制小胶质细胞增殖，实现小鼠脑内小胶质细胞的高效清除。近年来，小胶质细胞清除与再殖策略在多种神经系统疾病中被探索，包括卒中、创伤性脑损伤（TBI）、阿尔茨海默病（AD）、脑出血（ICH）和脊髓损伤（SCI）。这些研究强调小胶质细胞在维持稳态微环境中的不可或缺作用，并将小胶质细胞再殖视为有前景的治疗策略。

目前大多数研究在损伤前诱导小胶质细胞清除，对于再殖后小胶质细胞如何重塑脑免疫微环境及其表型转变缺乏全面理解。此外，临床脑损伤通常不可预测，损伤前清除策略缺乏实用性。因此，探索损伤后清除策略并阐明再殖小胶质细胞调节脑免疫景观的机制具有重要意义。

2 结果

2.1 PLX5622治疗促进缺血性脑卒中慢性期炎症消退

本研究采用短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型，缺血后7天内给予PLX5622饮食（PLX组），随后7天恢复正常饮食允许小胶质细胞再殖。通过流式细胞术、细胞因子阵列和单细胞RNA测序等多技术手段评估治疗效果。

细胞因子阵列分析显示，PLX组促炎因子（CD14、CD40、TNF等）减少，抗炎细胞因子（IL-4、骨桥蛋白Spp1）增加。单细胞转录组分析发现PLX组小胶质细胞比例升高，浸润免疫细胞比例降低。流式细胞术证实PLX组B细胞和T细胞浸润减少，巨噬细胞比例无变化。功能评分显示PLX组小胶质细胞促炎评分降低，抗炎评分升高。

组织学分析显示PLX组梗死体积显著减小。行为学测试（粘附去除试验和足误试验）表明PLX组神经功能恢复改善。这些结果表明急性期PLX5622治疗将梗死脑区的免疫微环境从促炎状态转变为抗炎状态，从而促进神经功能恢复。

2.2 PLX5622对外周免疫细胞的影响

为探究PLX5622的脱靶效应，研究人员对外周免疫细胞进行分析。流式细胞术显示PLX5622主要影响外周单核细胞，对其他主要免疫细胞群的组成和功能影响有限。单细胞转录组分析显示两组主要免疫细胞类型具有高度相似的基因表达谱和炎症功能评分。

2.3 再殖小胶质细胞的表型和功能转变

单细胞数据分析表明再殖小胶质细胞与CD组小胶质细胞而非浸润巨噬细胞表型相似，且表达小胶质细胞特异性标志物Sall1和Sall3，表明其来源于残留小胶质细胞的自我增殖。

流式细胞术和免疫染色显示PLX组小胶质细胞比例增加、表面面积增大、TMEM119⁺IBA1⁺小胶质细胞比例升高。Sholl分析显示PLX组小胶质细胞突起复杂性增强，呈现更稳态的表型。

功能评分分析显示PLX组小胶质细胞稳态和修复特征评分更高，炎症和M1激活特征评分更低。单细胞聚类鉴定出10个不同小胶质细胞亚群，包括稳态小胶质细胞、炎症小胶质细胞、Trem2⁺小胶质细胞、Ms4a7⁺小胶质细胞、疾病相关小胶质细胞（DAM）等。

PLX组稳态小胶质细胞和Trem2⁺小胶质细胞比例升高，炎症小胶质细胞和干扰素相关小胶质细胞比例降低。拟时序分析显示CD组小胶质细胞主要向炎症小胶质细胞分化，而PLX组小胶质细胞则向DAM方向分化，并通过自我增殖扩增。Trem2⁺小胶质细胞作为从稳态小胶质细胞向DAM转变的中间状态，在PLX组比例增加，可能有助于增强功能恢复。

2.4 PLX5622治疗重塑浸润免疫细胞的组成和功能

对CD45^hi免疫细胞的单细胞转录组分析鉴定出14个 distinct免疫细胞群体。PLX5622治疗引起CD45^hi细胞组成的显著改变，表现为单核来源细胞（MF）和CD8⁺ T细胞比例增加，CD4⁺ T细胞和中性粒细胞比例减少。B细胞比例从7.76%急剧降至0.25%。

T细胞分析显示PLX组CD8⁺ T细胞比例增加，CD4⁺ T细胞比例减少。功能评分表明PLX组T细胞主要呈现效应特征，而CD组则更多表现耗竭和记忆样特征。小胶质细胞高表达B2m（MHC I分子组分），可能通过增强TCR/pMHC相互作用支持CD8⁺ T细胞维持。

巨噬细胞分析显示PLX组MF1和MF3比例增加，MF4和单核细胞比例减少。功能评分表明PLX组浸润巨噬细胞表现出更强的吞噬相关特征。免疫荧光染色证实GPNMB⁺巨噬细胞具有增强的吞噬能力，流式细胞术验证PLX组GPNMB⁺巨噬细胞比例增加。

中性粒细胞分析显示PLX组NP3比例显著降低。功能评分表明PLX组中性粒细胞凋亡相关特征减少。NP3具有最高的凋亡相关评分和炎症因子表达，是维持卒中后炎症反应的关键亚群。

2.5 再殖小胶质细胞抑制外周免疫细胞招募

机制研究表明，小胶质细胞是卒中后14天趋化因子产生的主要来源。PLX组小胶质细胞趋化因子相关功能评分显著降低，关键趋化因子（Ccl2、Ccl3、Ccl4、Cxcl16）在所有亚群中表达减少。

有趣的是，PLX组CD45^hi免疫细胞趋化因子受体表达显著上调。深入分析发现，单核细胞主要表达Ccr2和Ccr5；中性粒细胞早期浸润亚群NP2主要表达Cxcr6、Cxcr1和Cxcr2；T细胞中Ccr7和Cxcr4主要在CD4⁺ T细胞和Tregs表达，Ccr5和Cxcr3主要在CD8⁺ T细胞表达。

调节性T细胞（Treg）分析发现Treg 2代表激活的Tregs，高表达Itgae和Icos，具有更强的促修复和抗炎功能。PLX组Treg 2的Cxcr4表达最显著增加，而小胶质细胞中Cxcl12（Cxcr4配体）表达显著上调，可能促进激活Tregs的招募。

细胞因子阵列分析证实PLX组多个参与CD4⁺ T细胞招募的趋化因子（CCL2、CCL3、CCL4、CCL21、CCL22）在蛋白水平减少。有趣的是，CD8⁺ T细胞招募的关键趋化因子CCL5表达增加，可能部分解释PLX组CD8⁺ T细胞比例增加的现象。

2.6 PLX5622治疗通过抑制内皮与免疫细胞相互作用促进血脑屏障完整性

BBB完整性评估显示，PLX组Evans Blue渗出面积减少，IgG免疫荧光强度降低，表明BBB完整性改善。

内皮细胞分析发现静脉内皮细胞主要表达Icam1和Vcam1（免疫细胞粘附关键介质），PLX组这两种分子表达显著下调。免疫染色证实PLX组Vcam1和Icam1覆盖减少。

值得注意的是，PLX组外周浸润免疫细胞的整合素和其他粘附分子表达增加。研究人员推测，在迁移过程中，内皮细胞可能在介导免疫细胞浸润中起主导作用。PLX组内皮细胞Icam1和Vcam1表达减少，可能需要外周免疫细胞更高粘附分子表达以促进浸润。

神经血管单元组分分析显示PLX组周细胞、星形胶质细胞和内皮细胞比例显著增加。星形胶质细胞鉴定出两个亚群，PLX组ASC1比例增加，该亚群具有更高的星形胶质细胞终足形成评分。免疫染色显示PLX组AQP4（星形胶质细胞终足形成关键分子）与CD31共定位增加，表明胶质界膜形成增强。

周细胞分析显示PLX组增殖集群比例增加。免疫染色显示PLX组PDGFRβ与CD31共定位增加，表明周细胞覆盖增强。此外，鉴定出表达Acta2的周细胞亚群（向平滑肌样细胞转化），在PLX组略有增加，可能通过调节微血管收缩影响血流和卒中预后。

细胞互作分析显示PLX组小胶质细胞与星形胶质细胞和周细胞的相互作用权重最强。Cadm1介导的相互作用增强，Psap（激活星形胶质细胞上Gpr37l1受体）表达升高，增强星形胶质细胞抵抗氧化应激和细胞死亡的能力。对于周细胞，Spp1信号轴（编码骨桥蛋白，限制炎症和促进轴突再生）和Tgfb1信号轴显著增强，促进周细胞增殖和覆盖，有助于BBB稳定。

2.7 PLX5622治疗后外周免疫细胞的增殖能力和功能重编程

细胞周期评分评估显示，除CD8⁺ T细胞外，其他T细胞亚群（特别是CD4⁺ T细胞和γδT细胞）在PLX组增殖比率降低。巨噬细胞未见显著增殖变化。凋亡相关基因特征评分显示，中性粒细胞亚群无显著差异，但CD4⁺ T细胞、Tregs、NKT细胞和γδT细胞在PLX组凋亡水平增加，而单核细胞、MF1和MF3显示凋亡评分降低。

免疫荧光显示GPNMB⁺IBA1⁺细胞比GPNMB^-IBA1⁺细胞凋亡率更低，表明向GPNMB⁺巨噬细胞分化可能赋予更强的凋亡抗性。

分化轨迹分析发现浸润单核细胞有两条主要分化路径：Branch 1产生抗原呈递巨噬细胞，Branch 2通向干扰素相关或吞噬相关巨噬细胞。PLX5622早期治疗后，单核细胞优先分化为干扰素相关和吞噬相关巨噬细胞。DEGs分析发现Branch 2中38个基因特异性上调，其中S100a4（对趋化性、迁移和向M2样巨噬细胞分化关键）表达显著升高。

中性粒细胞分化轨迹分析显示两条不同路径：Branch 1通向干扰素（IFN）相关中性粒细胞，Branch 2通向终末分化中性粒细胞。PLX组中性粒细胞主要遵循Branch 1，表明重塑的微环境可抑制浸润中性粒细胞的终末分化。调控网络分析鉴定Klf6（中性粒细胞成熟和终末分化的关键调节因子）和Maff（与炎症相关）为驱动中性粒细胞向NP3分化的核心转录因子。相反，Irf7和Stat1（干扰素信号关键转录因子）在NP4中富集。PLX5622治疗可能通过抑制终末分化相关因子（Klf6、Maff）和增强干扰素相关转录程序（Irf7、Stat1）调节中性粒细胞转录活性。

3 讨论

本研究提出了一种新型治疗策略——急性期使用PLX5622短暂清除小胶质细胞，随后在亚急性期允许其再殖。该策略恢复了小胶质细胞稳态，创建了更稳定的微环境，增强BBB完整性，并有效抑制外周免疫细胞浸润。此外，重塑的免疫微环境促进浸润免疫细胞向有益表型转变，从而促进神经功能恢复。这种时间靶向性的小胶质细胞调节为卒中治疗提供了有前景且临床可转化的策略。

再殖小胶质细胞与CD组小胶质细胞表型相似，表达卵黄囊来源小胶质细胞特异性标志物Sall1和Sall3，表明其来源于残留小胶质细胞的自我增殖。同时发现的Ms4a7⁺小胶质细胞高表达Apoe、Lyz2和Ms4a7，具有更高的外周浸润巨噬细胞评分，提示可能来源于外周。这些细胞的长期命运和对慢性脑微环境的影响需进一步研究。

早期小胶质细胞衰减导致稳态小胶质细胞比例增加和促炎亚型减少，与近期研究发现小胶质细胞再殖有助于正常化促炎信号一致。早期PLX5622治疗可能清除过度激活的小胶质细胞并减轻卒中后炎症，这种较温和的炎症环境可能防止过度小胶质细胞激活，维持再殖小胶质细胞处于更稳态。此外，PLX5622治疗后外周免疫细胞浸润减少和修复亚群增加可能进一步促进这种转变。

浸润免疫细胞在卒中后经历动态功能转变，恢复免疫稳态对恢复至关重要。急性期PLX5622治疗导致后期中性粒细胞、B细胞和T细胞减少，并深刻重编程其表型和功能，导致促炎表型减少和修复相关亚群增加。CD8⁺ T细胞比例增加可能源于增强的趋化信号（Ccr5表达升高）和克隆增殖（增殖性CD8⁺ T细胞比例增加）。CD8⁺ T细胞在重塑微环境中的确切作用需进一步研究。

BBB完整性在卒中后经历动态变化。急性期（3天内）BBB主要经历神经炎症相关的破坏，随后从亚急性期（1-3周）开始修复机制启动。炎症微环境与胶质和免疫细胞的相互作用重塑BBB完整性。本研究重点关注小胶质细胞与BBB的相互作用，发现小胶质细胞相互作用权重增加最大，且在调节BBB完整性中起关键作用。其他免疫细胞重塑如何影响BBB完整性需要进一步研究。

4 局限性

PLX5622不仅清除脑常驻小胶质细胞，还引起长期系统改变，影响组织和循环髓系和淋巴系区室，改变脑内皮细胞胆固醇代谢并引起全身代谢紊乱，可能混淆实验结果。因此，应进一步采用细胞特异性遗传模型以更好阐明小胶质细胞再殖对卒中的影响。研究结果在小鼠中的临床相关性需在人体研究中进一步验证。大多数发现主要基于单细胞水平分析，缺乏相应的实验验证。近期研究表明性别影响TBI模型中小胶质细胞再殖后的预后，未来分析中应考虑性别差异。

5 方法

研究使用8-12周龄雄性C57BL/6小鼠。tMCAO模型通过左大脑中动脉（MCA）血管内闭塞60分钟建立。行为测试包括粘附去除试验和足误试验。PLX5622通过饮食给药（1200 PPM），从MCAO当天开始持续至7 dpi。采用细胞因子阵列、免疫染色、流式细胞术和单细胞RNA测序等技术进行分析。单细胞数据使用Seurat包处理，采用harmony函数去除批次效应，通过UMAP和tSNE进行可视化。差异表达基因使用Wilcoxon秩和检验鉴定。功能富集分析使用Metascape进行。拟时序分析使用Monocle进行。功能基因集模块评分使用AddModuleScore方法计算。细胞互作分析使用CellChat包进行。单细胞调控网络推断使用pySCENIC包进行。统计分析和图表制作使用R和GraphPad Prism进行。