苯甲酸钠、山梨酸钾与柠檬酸食品防腐剂联合暴露诱导大鼠雄性生殖系统凋亡的机制研究

《BioMed Research International》：Sodium Benzoate, Potassium Sorbate, and Citric Acid Food Preservatives Trigger Apoptosis in the Male Reproductive System of Rats

本研究发现，在无可见不良效应水平（NOAEL）剂量下，苯甲酸钠（SB）、山梨酸钾（PS）及柠檬酸（Cit）的单独或联合暴露，会通过氧化应激（MDA升高）、细胞凋亡（Bax/Bcl-2比值及caspase-3上调）和睾酮水平抑制，导致大鼠睾丸重量减轻、精子数量减少、活力下降及睾丸组织结构退化。该研究警示了常见食品防腐剂联合使用对雄性生殖健康的潜在风险，为食品安全评估提供了重要实验依据。

　　

引言

食品添加剂的安全性日益受到关注。虽然限值内的单一添加剂被认为安全，但联合摄入或超每日允许摄入量（ADI）可能产生协同效应。苯甲酸钠（SB，E211）、山梨酸钾（PS，E202）和柠檬酸（Cit，E330）是广泛使用的防腐剂。SB的FDA可接受摄入量为0–5 mg/kg体重，研究显示其与肝肾功能损伤、胃肠道问题及生殖激素改变相关。PS的JECFA每日允许摄入量为25 mg/kg体重，可诱导人淋巴细胞遗传毒性和DNA链断裂。Cit虽为FDA批准的天然酸，但报道显示其对牙细胞有毒性，并可能导致肝细胞改变和染色体损伤。既往研究表明，PS可改变大鼠精液参数和睾丸结构，SB通过氧化应激加剧睾丸毒性。然而，这些防腐剂的联合效应尚不明确。

方法

36只雄性Sprague–Dawley大鼠经1周适应后分为6组（n=6）：对照组（无添加剂）、Cit组（1200 mg/kg Cit）、SB组（500 mg/kg SB）、PS组（300 mg/kg PS）、Cit+SB组（1200 mg/kg Cit + 500 mg/kg SB）和SB+PS组（500 mg/kg SB + 300 mg/kg PS），通过饮水给药8周。结束后采集血液及睾丸、附睾组织。分析指标包括器官重量指数、精子特性（数量、活力、存活率）、血浆睾酮（ELISA法）、睾丸氧化应激参数［活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、铁还原抗氧化能力（FRAP）］、凋亡相关基因（Bax、Bcl-2、caspase-3）表达（qRT-PCR）及组织病理学（Masson染色）。

结果

器官重量指数：除Cit组外，所有处理组睾丸相对重量均显著降低（p<0.05）；附睾相对重量在所有处理组均显著增加（p<0.05）。

精子特性：SB和PS+SB组总精子数显著减少（p<0.05）；PS和PS+SB组精子存活率下降；PS、SB及PS+SB组精子运动力显著降低，不动精子比例增加。

血清睾酮水平：所有处理组均显著降低（p<0.001），PS+SB组降低最显著。

氧化应激参数：各组ROS无显著变化；PS、PS+SB和Cit+SB组MDA显著升高（p<0.05）；FRAP无显著变化。

凋亡诱导：除SB组外，所有处理组Bax表达均上调（p<0.01或p<0.001）；Bcl-2在Cit+SB组显著增加（p<0.001），PS+SB组无变化；PS和PS+SB组Bax/Bcl-2比值显著升高（p<0.05）；PS和PS+SB组caspase-3表达显著增加（p<0.001）。

组织病理学：对照组睾丸结构正常；Cit组可见生精小管上皮排列紊乱和出血；SB组出现上皮细胞碎片和血管扩张；PS及Cit+SB组显示细胞连接异常、上皮碎片、血管扩张和出血；SB+PS组见异常细胞连接和出血。组织形态计量显示，联合组（Cit+SB和SB+PS）生精上皮厚度显著减少（p<0.05），生精小管直径无显著变化。Leydig细胞、Sertoli细胞、精原细胞数量在所有处理组均减少（p<0.05）；精母细胞在Cit组减少；精子细胞在Cit、PS和Cit+SB组减少。聚类分析显示，Cit组与其他组差异较大，精原细胞与精母细胞、Sertoli细胞与Leydig细胞分别具较高相似性。

讨论

SB和PS给药显著降低睾丸和附睾重量指数，与既往生殖毒物通过损害精子发生和氧化应激影响睾丸重量的报道一致。PS+SB组合减少精子数量，PS及PS+SB降低精子存活率和运动力，可能与睾酮下降和MDA升高导致的精子膜完整性受损有关。所有组睾酮水平显著降低，以Cit、PS及PS+SB组最明显，而睾酮对维持睾丸结构和精子发生至关重要。ROS稳定但MDA升高提示抗氧化系统不足以阻止脂质过氧化。PS和PS+SB组通过Bax/Bcl-2比值和caspase-3上调诱导凋亡，与睾酮减少和睾丸重量下降相关。组织学显示生精上皮变薄但小管直径不变，表明选择性生殖细胞丢失而结构基本保留，可能源于激素失衡或氧化应激特异影响生精上皮。各阶段生精细胞减少表明精子生产全面受损，与El-Shennawy等报道的SB剂量依赖性生殖毒性（涉及炎症、氧化应激和凋亡）及Adana等显示的PS改变精液参数和睾丸结构一致。

结论

研究表明，SB、PS和Cit在NOAEL剂量下单独或联合使用，可通过脂质过氧化、睾酮抑制和细胞凋亡损害睾丸功能，导致精子生产减少、活力下降及睾丸组织退化。值得注意的是，虽Cit属GRAS，但本研究首次揭示其对雄性生殖系统的 adverse 效应。防腐剂联合使用可能在大鼠中引发生殖问题，警示了其对人类健康的潜在影响。